癡呆和阿爾茨海默病

 

癡呆（Dementia）的種類很多，除了阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD，也叫老年癡呆）以外，還有血管性癡呆（Vascular dementia），額顳葉癡呆（Frontotemporal dementia）和路易小體癡呆（Dementia with Lewy bodies）等。其他疾病如亨廷頓綜合征（Huntington disease）或帕金森綜合癥（Parkinson disease）也伴有癡呆癥狀產(chǎn)生。不過，AD是所有癡呆中占比最大的，達到6到7成。接下來就是血管性癡呆和額顳頁癡呆，分別占比約為10-20%和10%，剩下的癡呆類型相對較少。不僅在癡呆中占有最大的比例，AD也是神經(jīng)退行性疾病中占比最多的，甚至超過了其余神經(jīng)退行性疾病病患數(shù)量的總和。

 

從癥狀上看，AD會影響病患的空間記憶，具體表現(xiàn)為在熟悉的地方會迷路；其次會頻繁忘記剛剛做過的事情，比如忘記自己吃過午飯；還有就是對于以往非常熟練的技能會變得很生疏；逐漸忘記朋友甚至親人的名字；時間概念混亂。到后期還會逐漸出現(xiàn)情緒暴躁、回避社交行為以及語言功能障礙等問題，最后生活不能自理直至各種器官衰竭而死去。

 

圖1. 阿爾茨海默癥癥狀及其在癡呆中的比例[1, 2]

 

阿爾茨海默癥負擔沉重但科研投入不足

 

這樣嚴重的疾病常常被我們當做是“老糊涂”了，在癥狀初期沒有給予足夠的重視，任其發(fā)展到晚期時已無可挽回。據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）2015年的統(tǒng)計，該年美國投入在癌癥研發(fā)上的經(jīng)費為50億美元，而投入在阿爾茨海默病上的只有5億美元；但是，美國全社會卻承擔著由阿爾茨海默癥帶來的2000億美元的沉重負擔，而所有癌癥造成的負擔加起來只有AD的一半；另一方面美國每年因阿爾茨海默病死亡的人數(shù)與罹患癌癥而死的人數(shù)幾乎相等。阿爾茨海默病之所以造成如此之重的經(jīng)濟負擔，除了對病患的治療費用以外，更大的花費在對于患者的看護上，而且AD發(fā)病后相對癌癥而言持續(xù)時間長，需要占用看護者的大量時間和精力，并剝奪了其創(chuàng)造社會價值的機會成本。

 

圖2. 2015年美國阿爾茨海默病與癌癥研發(fā)投入對比[3]

 

阿爾茨海默癥假說及藥物研發(fā)現(xiàn)狀

 

隨著多年來對AD研究的深入，我們已經(jīng)了解到AD有兩大病例特征，即患者腦中會存在大量由Aβ（Amyloid Beta）聚集而成的淀粉樣沉淀和由tau聚集而成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，其中Aβ由APP（Amyloid Precursor Protein）經(jīng)過兩次剪切而成（BACE1剪第一刀，含有PS1/2的γ剪切酶負責補上一刀），tau蛋白則由MAPT（微管結(jié)合蛋白tau）基因編碼而來，并被過度磷酸化而聚集成纖維纏結(jié)。雖然現(xiàn)在我們投入巨大精力研究了APP，Aβ，BACE1（β-Secretase），PS1（γ-Secretase的組成部分）以及tau，并以這些蛋白作為靶點開發(fā)藥物，但這些藥物在最終臨床階段幾乎全部折戟沉沙。目前獲批的藥物僅僅是三種乙酰膽堿酶抑制劑和一種NMDA受體（一種介導(dǎo)神經(jīng)興奮性的受體）的抑制劑以及和腸道菌群相關(guān)的GV971，而且GV971目前機理不明確且沒有獲得廣泛使用，而前面幾種只能暫時緩解AD癥狀，并不能起到治療AD的作用，甚至連延緩病程也無法做到。

 

所以幾十年的研究中人們雖然對AD的認識在不斷深化，但在治療上并不像腫瘤和艾滋病以及傳染性疾病上那樣有實質(zhì)性的突破。在臨床、動物、細胞等實驗中各種不一致的現(xiàn)象讓AD的機理更加撲朔迷離。另外值得注意的是，在臨床前的模式動物研究中，主要的基因編輯對象是Aβ源頭蛋白APP，以及γ剪切酶中的PS1以及β剪切酶（BACE1），其中前兩種基因的一些突變會造成AD發(fā)病程度的加重和發(fā)病時間的提前。我們把這兩種基因突變造成的AD稱為早發(fā)型AD。但這種遺傳性AD病例在所有的患者中只占不到5%的比例。真實情況是大部分病例是散發(fā)性的，即發(fā)病時間一般在65歲之后，并且也沒有APP和PS1的突變。而臨床實驗中面對的大部分病例屬于散發(fā)型，這或許是在模式動物中形勢喜人的藥物進入臨床后期后，效果令人失望的原因。

 

而另一個AD中形成神經(jīng)纖維纏結(jié)的tau蛋白編碼基因MAPT，其突變并不會直接造成Aβ的聚集，也不會產(chǎn)生淀粉樣沉淀。MAPT的突變是額顳葉癡呆的主要誘因之一，但AD卻幾乎與這種突變無關(guān)。AD病患腦中的tau聚集目前主流認為是Aβ或者炎癥引起的。針對該蛋白，雖然人們制作了很多基因編輯小鼠進行臨床前研究，也的確提升了我們對AD的了解，但針對tau作為靶點的藥物目前暫無令人振奮的結(jié)果。

 

圖3. 阿爾茨海默癥的Aβ假說[4]

 

APOE基因

 

有鑒于前文所述對AD不太成功的藥物研發(fā)經(jīng)歷，我們能否暫時跳出思維定式，將目光轉(zhuǎn)向其他的研究方向呢？

 

早在1993年，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種叫做APOE的載脂蛋白，隨后的研究又發(fā)現(xiàn)這個蛋白與占AD病例95%的散發(fā)性AD有顯著的聯(lián)系。人類APOE基因位于第19號染色體上，編碼一個299個氨基酸的APOE蛋白。

 

該蛋白在人群中主要有三種，即APOE2，APOE3和APOE4。它們的區(qū)別在于APOE基因水平上兩個位點的改變，反應(yīng)到蛋白層面就是這兩個位點（第112個氨基酸和第158個氨基酸）究竟是半胱氨酸（Cys）還是精氨酸（Arg）：

 

● 如果一條染色體上編碼得到的APOE兩個位點都是Cys，這條染色體就是APOE2型；

 

● 如果第112號位是Cys，而第158號位是Arg，那么這個載脂蛋白就是APOE3；

 

● 如果兩個都是Arg，那就是APOE4。

 

由于我們都有兩條染色體，一條來自老爸，一條來自老媽，在形成受精卵時你便有可能得到APOE的6種組合（E2/E2，E2/E3，E3/E3，E3/E4，E2/E4及E4/E4）。

 

注：這里有同學(xué)可能要問為什么沒有1型，答案是有的。其實還有5型，只不過這兩種在人群中出現(xiàn)的概率極低（加起來不到0.1%，而且其變化依據(jù)是其他位點的氨基酸）。此外還有一種被命名為APOE3r的蛋白，該蛋白與APOE3正好相反，112位為Arg，158位為Cys，這種出現(xiàn)的概率也很低，因此我們在接下來的內(nèi)容中會重點講述在人群中分布最廣的2/3/4型APOE。

 

圖4. 人類APOE基因多態(tài)性[5]

 

人類APOE多態(tài)性影響AD發(fā)病率

 

在一項研究大樣本的研究中，通過檢測正常人群和輕度認知障礙人群中淀粉樣沉淀和APOE基因型之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，無論是在哪種人群中，淀粉樣蛋白沉淀隨年齡增加的速度是APOE4 > APOE3 > APOE2。值得注意的是，APOE2的純合人群中，其淀粉樣蛋白的聚集幾乎沒有隨年齡增長而增加。

 

我們把分布最廣的APOE3純合人群的AD發(fā)病率作為基準，含有APOE4人群的AD發(fā)病率都是高于APOE3純合人群的，兩種雜合含APOE4的人群阿爾茨海默病的患病概率分別是APOE3純合的2.6和3.6倍；而純合的APOE4的AD發(fā)病率則猛增到15.5倍。但兩種APOE2基因型的人群中AD發(fā)病率幾乎只有APOE3的一半。這項研究說明，APOE4基因只要存在就會提高AD發(fā)病的概率，而APOE2能在一定程度上阻止AD的發(fā)生。

 

圖5. APOE多態(tài)性對AD發(fā)病率的影響[6]

 

APOE4對阿爾茨海默癥發(fā)病機理的影響

（Aβ假說層面）

 

根據(jù)尸體解剖研究發(fā)現(xiàn)，APOE4在AD病患的腦中與神經(jīng)元內(nèi)的Aβ結(jié)合并聚集，從而形成淀粉樣蛋白沉淀，并且與Aβ寡聚體（有研究表明寡聚體的毒性高于淀粉樣沉淀）的數(shù)量正相關(guān)。首先我們要知道，三種APOE都能與Aβ直接結(jié)合，進而影響Aβ的清理和聚集。不過Aβ和APOE4的關(guān)系尤為親密，二者親和力最高。在各種APOE過表達的小鼠中，研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入APOE4基因的小鼠腦脊液中，Aβ含量是APOE2或者APOE3的2~4倍。另一項研究也發(fā)現(xiàn)星型細胞（Astrocyte）中APOE4的過量表達會引起細胞外Aβ的聚集，但這種現(xiàn)象在另兩種APOE小鼠中沒有發(fā)生。向人源化的幾種APOE小鼠腦中注射Aβ，會加劇hAPOE4小鼠的淀粉樣蛋白聚集，而hAPOE3小鼠則不受影響。

 

除了加劇Aβ的聚集外，APOE4也會抑制Aβ的清理，這一方面是由于APOE4與Aβ結(jié)合，導(dǎo)致部分蛋白降解通路成員無法順利結(jié)合Aβ，另一方面APOE4還會與Aβ競爭LRP1介導(dǎo)的細胞吸收作用，導(dǎo)致Aβ無法被及時清除，因此加劇了Aβ的聚集并損傷了相應(yīng)APOE敲入小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能。Aβ的清理需要通過血腦屏障（blood–brain barrier，BBB）進入血管，讓Aβ被血液帶走。有研究表明APOE2/3-Aβ復(fù)合物是通過VLDLR和LRP1兩種受體穿過BBB的，而到了APOE4-Aβ復(fù)合物，就只能通過VLDLR了。要知道，VLDLR介導(dǎo)的APOE-Aβ內(nèi)吞效率遠低于LRP1，因此，APOE4占主導(dǎo)的話，Aβ的清理就會被延誤。Neprilysin和IDE（insulin- degrading enzyme）是兩種負責Aβ清理酶的重要蛋白水解酶，攜帶APOE4基因的病患海馬中，這兩種酶的含量要大大低于非APOE4攜帶者。

 

圖6. APOE4對阿爾茨海默癥發(fā)病機理的影響[6]

 

APOE4對阿爾茨海默癥發(fā)病機理的影響

（非Aβ假說層面）

 

在Aβ之外，也有研究發(fā)現(xiàn)攜帶純合APOE4的人要比雜合子人群大腦中含有更多的tau聚集，在小鼠神經(jīng)元中特異性過表達APOE4會提高tau的磷酸化水平。通過將tau突變小鼠（P301S）與不同人源化APOE小鼠進行雜交，在得到的三種APOE-tau小鼠中，發(fā)現(xiàn)在動物飼養(yǎng)到9月齡時，APOE4-tau小鼠表現(xiàn)出明顯的大腦萎縮和神經(jīng)炎癥。

 

在突觸可塑性方面，APOE4也會減少樹突密度，并通過減少突觸谷氨酸受體影響突觸可塑性。尸檢中也發(fā)現(xiàn)一系列突觸標志物（如PSD95，Synaptophysin，Syntaxin1等）都在APOE4攜帶者中明顯下降。動物方面，人源化APOE4小鼠比起APOE3小鼠及未經(jīng)人源化的野生型小鼠而言，突觸標志物蛋白表達、樹突棘的密度和長度，突觸傳遞效率都下降顯著。

 

體外培養(yǎng)的人類神經(jīng)干細胞中，三種APOE的酯化能力（結(jié)合脂類物質(zhì)的量）由大到小依次為APOE2，APOE3，APOE4。膽固醇從細胞內(nèi)向腦脊液中運輸?shù)哪芰σ彩茿POE4最低。這種不同APOE載脂能力的差異在人源化APOE的小鼠中也得到了證實。

 

人們發(fā)現(xiàn)在AD發(fā)病前的很多年，這些人大腦中的糖代謝能力就已經(jīng)開始減弱。胰島素、胰島素受體、胰島素信號通路也在AD病患中受到損傷并影響到其認知能力。大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)APOE4攜帶者，會增加患糖尿病和胰島素抵抗等AD風險。上述這些臨床結(jié)果與人源化APOE4小鼠中進行的實驗結(jié)果一致，并且更進一步發(fā)現(xiàn)了這種對糖代謝的影響是通過下調(diào)PPARγ的表達及其信號通路實現(xiàn)的。在高脂食物飼養(yǎng)的情況下，APOE4小鼠比APOE3的糖分吸收能力低，同時也產(chǎn)生了胰島素抵抗以及認知功能的損傷。小鼠在年輕時（3月齡）吃高脂食物并不會因為APOE的不同而影響胰島素信號通路，但在22月齡時APOE基因型的不同就會造成糖代謝功能的明顯差異。

 

此外APOE也在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)損傷修復(fù)、α-Synuclein（PD致病蛋白）調(diào)節(jié)等多方面對AD產(chǎn)生影響。

 

一系列的研究表明，與分布最為廣泛的APOE3相比，APOE4等位基因會通過各種手段增加患上AD的風險，不論是在臨床相關(guān)性的觀察，還是在動物或者細胞實驗中的因果關(guān)系驗證上都為我們以APOE4作為靶點對抗AD打下了堅實的基礎(chǔ)。

 

圖7. APOE4影響AD發(fā)病的可能途徑[6]

 

未來APOE模式動物的應(yīng)用

 

APOE調(diào)節(jié)膽固醇運輸和脂類代謝，Apoe敲除小鼠也是研究這類相關(guān)疾病的理想實驗動物，在Apoe敲除小鼠中會有自發(fā)的動脈粥樣硬化癥狀產(chǎn)生。如果我們把APOE3的功能作為基準，除了前文敘述過的不同APOE間的區(qū)別外：

 

● APOE2和APOE4與血漿甘油三酯的結(jié)合能力都要高于APOE3；

 

● 與血漿膽固醇的結(jié)合能力則是按APOE2，APOE3，APOE4的順序逐漸遞增；

 

● 蛋白穩(wěn)定性按APOE2，APOE3，APOE4的順序依次降低；

 

● APOE2與LDLR的親和力遠低于APOE3和APOE4；脂類結(jié)合能力上APOE4最強，同時其也是與VLDL親和力最高的APOE蛋白，另外兩種傾向于結(jié)合HDL。

 

在疾病方面，仍然將APOE3作為野生型看待，那么APOE2和APOE4都有3型高膽固醇血癥的可能；不同的是，APOE2更有可能誘發(fā)外周血管疾病和動脈粥樣硬化心血管疾病，而APOE4則更容易誘發(fā)心血管疾病和阿爾茨海默癥（圖8）。

 

當然，APOE的本職工作其實就是在中樞或者外周負責膽固醇以及其他脂類的調(diào)度運輸。目前總體而言，APOE在外周的功能其實研究得比中樞更加深入。不同的APOE雖然至多只有兩個氨基酸的差異，但是這種差異卻造成了結(jié)構(gòu)上的改變，以至于不同APOE與其受體的結(jié)合能力產(chǎn)生了很大的差異，進而影響不同人群中和脂類相關(guān)的生理和病理過程。舉例說來，APOE2與LDLR受體的結(jié)合能力不到APOE3和APOE4與LDLR結(jié)合能力的1/50。因此，在外周，APOE2會造成富含甘油酸三酯的脂蛋白殘余聚集成顆粒，進而引起三型高脂蛋白血癥。另一個例子就是關(guān)于APOE4的了，APOE4更容易與VLDL形成顆粒，妨礙脂肪在外周組織中的分解，從而產(chǎn)生動脈粥樣硬化的潛在危險。

 

圖8. 三種APOE蛋白的主要差異總結(jié)[7]

 

小鼠本身只有一種APOE，而人類中的APOE則有三種主要形式。要透徹研究APOE的功能，就需要將人類的三種APOE在小鼠中表達。在以前的很多研究中，通常是構(gòu)建APOE過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠進行實驗。把這些小鼠和傳統(tǒng)的AD基因編輯小鼠雜交后的確也能產(chǎn)生反映APOE多態(tài)性與AD關(guān)聯(lián)的表型，但過表達并非理想的基因編輯方式，一方面是因為過表達量使蛋白豐度有違生理狀態(tài)，另一方面則是目的基因的隨機插入有可能破壞原有基因功能，對目的表型產(chǎn)生干擾。因此，在不改變小鼠原有APOE啟動子的情況下，將人的APOE蛋白（hAPOEs）替換原有的小鼠APOE進行的研究會更有意義，也更易將實驗結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化。而且從結(jié)果上來看，hAPOE4小鼠也產(chǎn)生了認知障礙和神經(jīng)突觸的損傷。并且在與引入了hAPP突變的小鼠雜交后，hAPOE4-hAPP小鼠也能產(chǎn)生淀粉樣沉淀，并且hAPOE4-hAPP小鼠產(chǎn)生的Aβ沉淀的量要高于hAPOE3-hAPP小鼠。

 

圖9. APOE敲除及人源化小鼠主要應(yīng)用領(lǐng)域

 

關(guān)于APOE多態(tài)性與疾病的很多研究都是在臨床上先觀察現(xiàn)象，統(tǒng)計規(guī)律，提出假說，然后再利用人源化的APOE小鼠進行實驗，對因果關(guān)系進行驗證。利用APOE小鼠，我們可以對脂類代謝、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)中APOE作用的機理進行研究，也可以與很多疾病固有的模型小鼠進行雜交，尋找APOE與疾病固有的信號通路之間有著怎樣的相互作用關(guān)系。因此，在對疾病病理的探索和相應(yīng)靶點的發(fā)現(xiàn)上，APOE基因編輯小鼠都將成為研究者們手中不可或缺的利器。

 

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參考文獻及引用圖片來源：

1. https://qbi.uq.edu.au/brain/dementia/types-dementia

2. https://www.urgentteam.com/news/determining-alzheimers-symptoms

3. https://www.ted.com/talks/samuel_cohen_alzheimer_s_is_not_normal_aging_and_we_can_cure_it

4. Patterson C , Feightner J W , Garcia A , et al. Diagnosis and treatment of dementia: 1. Risk assessment and primary prevention of Alzheimer disease[J]. Canadian Medical Association Journal, 2008, 178(5):548-556.

5. https://www.fatforweightloss.com.au/genetic-makeup

6. Yamazaki, Y., Zhao, N., Caulfield, T.R. et al. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: pathobiology and targeting strategies. Nat Rev Neurol 15, 501–518 (2019).

7. Bos M M , Noordam R , Blauw G J , et al. The ApoE ε4 Isoform: Can the Risk of Diseases be Reduced by Environmental Factors?[J]. The Journals of Gerontology Series A Biological Sciences and Medical Sciences, 2018.