當(dāng)我們提到“safe harbour”，你首先想到的什么呢？我們今天要討論的不是船只安全停泊的港口，而是小鼠基因組中外源基因定點(diǎn)整合的安全位點(diǎn)。接下來就讓我們一起探索小鼠基因組中的最經(jīng)典的安全位點(diǎn)之一：Rosa26，作為基因組中的安全位點(diǎn)是種怎樣的體驗(yàn)吧。

 

Rosa26：安全這塊我拿捏的死死地！

 

隨機(jī)整合存在哪些問題？

 

利用細(xì)胞系或者模式生物研究基因功能時(shí)，通常會(huì)通過功能缺失或獲得（gain of function/loss of function）策略來研究靶基因在細(xì)胞或者動(dòng)物內(nèi)的具體功能和調(diào)控機(jī)制。功能獲得通常通過基因敲入技術(shù)從而促使基因過表達(dá)實(shí)現(xiàn)，而功能缺失通常通過基因敲除方式獲得。在本文主要討論基因敲入模型。基因敲入（過表達(dá)）是指利用轉(zhuǎn)基因或同源重組等方式將外源功能基因或片段插入到基因組中，使其在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)發(fā)揮功能的技術(shù)。

 

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的小鼠，由于轉(zhuǎn)入的基因是隨機(jī)整合的，可能出現(xiàn)整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)不確定等問題，因此需要通過對(duì)后代的篩選才能獲得蛋白表達(dá)穩(wěn)定的小鼠。再加上傳代后拷貝數(shù)稀釋以及轉(zhuǎn)入位點(diǎn)容易導(dǎo)致周圍基因沉默等原因，同種首建鼠的表型在傳代過程中容易丟失，給后期的建系、重復(fù)試驗(yàn)帶來諸多不便。

 

那么是否存在一個(gè)不需要篩選又能讓轉(zhuǎn)入基因穩(wěn)定高表達(dá)并且也不影響轉(zhuǎn)入基因附近其他基因表達(dá)的位點(diǎn)呢？要想避開篩選并獲得基因穩(wěn)定表達(dá)的小鼠，就需要為外源基因提供一個(gè)安全可靠的停泊“港口”，在這些“港口”，外源基因既可穩(wěn)定高效表達(dá)，又對(duì)細(xì)胞和組織無副作用。

 

Rosa26的發(fā)現(xiàn)

 

研究人員在小鼠基因組中嘗試了各種不同的基因插入位置，他們發(fā)現(xiàn)有一兩個(gè)位點(diǎn)很特別，在這些位點(diǎn)放置任何DNA序列都非常安全穩(wěn)定，其中就有Rosa26位點(diǎn)。Rosa26的發(fā)現(xiàn)可能是基因改造史上最令人興奮的發(fā)現(xiàn)之一，并被視為整個(gè)遺傳學(xué)史上最重要的突破之一。

 

Rosa26最早是由Friedrich和Soriano在研究小鼠胚胎干細(xì)胞基因突變時(shí)發(fā)現(xiàn)的。Rosa26在科學(xué)界被稱為Gt(ROSA)26Sor, 是一個(gè)位于小鼠6號(hào)染色體上由三個(gè)外顯子構(gòu)成的非編碼基因，因?yàn)樵搮^(qū)域極易進(jìn)行基因插入操作，且由于其尚未發(fā)現(xiàn)功能性表達(dá)蛋白，加之容易進(jìn)行同源重組，插入該區(qū)域的蛋白可以很好的進(jìn)行表達(dá)，不會(huì)影響其他內(nèi)源性基因的表達(dá)和功能發(fā)揮，在所有細(xì)胞類型和發(fā)育階段均有廣泛表達(dá)，所以小鼠的Rosa26位點(diǎn)常常被用作基因打靶的安全位點(diǎn)。

 

Rosa26位點(diǎn)基因敲入模型分類

 

一般來說，有三種不同類型的Rosa26位點(diǎn)敲入：

 

● 第一種類型也是最原始版本，即敲入基因的cDNA是由ROSA26啟動(dòng)子控制并在體內(nèi)組成性表達(dá)的（圖a）。具體來說，接著cDNA的剪接受體（splice acceptor, SA)序列的感興趣的轉(zhuǎn)基因被插入到Rosa26基因第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的Xba1限制性酶切位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)基因的上游插入一個(gè)由新霉素抗性基因（NeoR，陽性選擇標(biāo)記）和三個(gè)聚腺苷酸（pA）位點(diǎn)組成的終止轉(zhuǎn)錄盒（STOP casscatte）。

 

● 第二種策略為條件性敲入，也就是第一種策略的變體，通過分別插入位于終止轉(zhuǎn)錄盒（STOP casscatte）兩側(cè)的loxP位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的（圖b）。在這種情況下，終止轉(zhuǎn)錄盒的存在可以阻止轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，而與表達(dá)Cre小鼠交配的方式，可以通過同源重組去除終止轉(zhuǎn)錄盒（STOP casscatte）序列。然而，中等強(qiáng)度的Rosa26啟動(dòng)子在某些情況下可能無法達(dá)到期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。

 

● 為了克服這一限制，第三種策略就是引入外源性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子（如CAG啟動(dòng)子）來驅(qū)動(dòng)Rosa26位點(diǎn)的高轉(zhuǎn)基因表達(dá)（圖c）。此外，為了監(jiān)測轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)的表達(dá)，可以在轉(zhuǎn)基因下游克隆一個(gè)兩側(cè)有frt位點(diǎn)的IRES-GFP盒。

 

圖片來源：Creative Biolabs官網(wǎng)

 

Rosa26的應(yīng)用

 

Rosa26位點(diǎn)靶向方法允許高頻率的正確插入和穩(wěn)定的單拷貝基因插入表達(dá)。結(jié)合Cre-loxp系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的時(shí)間和細(xì)胞類型的特異性控制。更重要的是，作為一種靶向基因敲入策略，所需的小鼠數(shù)量比BAC轉(zhuǎn)基因和PiggyBac轉(zhuǎn)基因要少，大大提升了工作效率，降低了生產(chǎn)成本。目前，利用Rosa26構(gòu)建的模型已廣泛應(yīng)用于基因功能、機(jī)體發(fā)育機(jī)制以及藥物開發(fā)等研究。

 

1. 實(shí)現(xiàn)小鼠的全身表達(dá)。利用Rosa26的廣譜性表達(dá)特性可以實(shí)現(xiàn)外源基因在動(dòng)物機(jī)體所有組織和細(xì)胞中的表達(dá)，如表達(dá)某些標(biāo)記基因，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及組織器官的標(biāo)記。

 

2. 作為基因打靶的安全位點(diǎn)之一，可用于某些待研究蛋白的過表達(dá)。

 

3. Rosa26品系是表現(xiàn)出廣泛lacZ染色的幾種品系之一。Rosa26小鼠似乎在所有造血細(xì)胞以及胚胎的所有組織中表達(dá)lacZ，因此它對(duì)許多應(yīng)用非常有用，比如嵌合體分析。

 

4. 將報(bào)告基因或毒素基因插入到Rosa26位點(diǎn)已廣泛用于特定細(xì)胞譜系示蹤，尤其是利用Cre-loxp位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)制備的細(xì)胞譜系示蹤模型和重組酶介導(dǎo)的基因交換模型最為典型。

 

目前，賽業(yè)利用Rosa26位點(diǎn)已經(jīng)建立了上千種基因敲入小鼠模型，除小鼠外，賽業(yè)生物還提供在大鼠和胚胎干細(xì)胞Rosa26位點(diǎn)的基因靶向修飾的服務(wù)，這些模型廣泛應(yīng)用于基因功能、疾病診斷與治療、干細(xì)胞功能與應(yīng)用、RNAi等領(lǐng)域。在小鼠、大鼠和胚胎干細(xì)胞中靶向修飾Rosa26，將有效解決常規(guī)轉(zhuǎn)基因修飾造成的諸多問題，為外源基因表達(dá)穩(wěn)定、表型一致的模型提供有效的途徑，必將推進(jìn)基因修飾模式動(dòng)物的研究和應(yīng)用。