mRNA純化之后的文庫構(gòu)建通常有兩種思路，一種是先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，再進行cDNA的片段化，另外一種則是先將mRNA打斷，再結(jié)合隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄。
 

1.先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA，再進行cDNA的片段化：此方法先得到長片段的cDNA，反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA之后再利用DNA片段化的方法進行片段化（酶切法或機械法），得到片段化dsDNA之后的建庫方法與DNA建庫方法完全一致。
 

2.先將mRNA打斷，再結(jié)合隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄：此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法、酶（RNaseIII）處理法，mRNA片段化之后應(yīng)立即進行一鏈cDNA合成，因為mRNA在該體系下非常容易降解。選擇金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法打斷時需根據(jù)需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時間。（一般設(shè)置為150-200bp 94°C，15 min； 200-300bp 94°C，10 min； 250-550 bp 94°C，5 min）

先針對mRNA進行打斷再進行反轉(zhuǎn)錄獲得測序reads主要是針對基因本體的；若先反轉(zhuǎn)錄，尤其是結(jié)合oligo(dT)進行反轉(zhuǎn)錄獲得的測reads對轉(zhuǎn)錄本3'端具有比較強的偏好性，所以在mRNA-Seq中建議采用先對mRNA打斷再進行反轉(zhuǎn)錄的文庫構(gòu)建方法。