過(guò)去三十年來(lái)，全球肥胖和2型糖尿病的發(fā)病率有所上升，而脂肪組織是肥胖相關(guān)疾病的重要因素，因此，控制脂肪細(xì)胞分化和成熟可能是治療肥胖相關(guān)疾病的一個(gè)有希望的策略（1）。為了闡明轉(zhuǎn)錄和表觀(guān)遺傳調(diào)控在脂肪形成中的作用，并確定一個(gè)主要的關(guān)鍵調(diào)控因子和途徑（1，2），人們做了大量的努力，然而，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在脂肪形成中的作用尚不清楚。

 

鋅指蛋白217（Zfp217，人類(lèi)同源蛋白ZNF217）是一種在多種人類(lèi)腫瘤（4，5）中上調(diào)的已知致癌蛋白，也是胚胎干細(xì)胞分化的關(guān)鍵蛋白（3，7，8）。值得注意的是，Zfp217將基因轉(zhuǎn)錄與新生RNA上的m6A修飾緊密結(jié)合，提示Zfp217在協(xié)調(diào)表觀(guān)遺傳和表觀(guān)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用（3，9）。雖然我們之前確定了一個(gè)新的角色對(duì)于脂肪發(fā)生中的Zfp217，詳細(xì)的Zfp217依賴(lài)機(jī)制尚未得到很好的描述（10，11）。然而，這些研究增加了Zfp217可能通過(guò)調(diào)節(jié)m6A修飾來(lái)加速脂肪生成的可能性。

 

為了闡明Zfp217蛋白在脂肪生成中的作用，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)系的彭建教授團(tuán)隊(duì)，通過(guò)sRNAi、CRISPR/Cas9、Co-IP， OpenSPR  LSPR技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法， 最終確定Zfp217通過(guò)介導(dǎo)m6A mRNA甲基化編排轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，促進(jìn)了脂肪分化并將該結(jié)果于2019年4月發(fā)表于《Nucleic Acids Research, 2019》（IF 11.5）。

 

 

 

具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

 

通過(guò)sRNAi、CRISPR/Cas9、流式、Co-IP， LC-MS/Ms、Chip等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)Zfp217，YTHDF2 ， FTO， m6A RNA之間在脂肪生成過(guò)程中形成了一個(gè)調(diào)控環(huán)路， Zfp217缺失會(huì)抑制脂肪生成，并通過(guò)OpenSPR的LSPR技術(shù)檢測(cè)確定了不同因子之間相互作用關(guān)系：

1）提取總RNA定量PCR分析，對(duì)m6A做點(diǎn)雜交及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)RNAi及CRISPR/Cas9處理后缺失了Zfp217的細(xì)胞中， m6A修飾水平明顯增加；LC-MS/Ms 發(fā)現(xiàn) m6Am在Zfp217缺失的細(xì)胞中顯著增加，m6A是m6Am的10倍，意示m6A可能是主要的關(guān)注點(diǎn)；點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)顯示，m6A的水平?jīng)]有變化。但是缺失Zfp217的細(xì)胞中，m6A 修飾顯著增加，暗示Zfp217對(duì)m6A RNA甲基化起關(guān)鍵的作用；并且pull-down實(shí)驗(yàn)顯示FTO 和YTHDF2與m6A ssRNA 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，CO-IP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Zfp217 與 YTHDF2存在相互作用。

 

 

2）LSPR 檢測(cè)：為了確定Zfp217 與 YTHDF2是否是直接相互作用及闡明上述三者之間的關(guān)系，本研究利用Nicoya OpenSPR 的LSPR技術(shù)，YTHDF2固定在芯片上，檢測(cè)了Zfp217與YTHDF2、、m6A ssRNA 三者之間的相互作用情況，結(jié)果顯示Zfp217 與 YTHDF2之間親和力很高，是直接相互作用，并且Zfp217會(huì)阻止包含m6A的 ssRNA與 YTHDF2的結(jié)合（圖2），這個(gè)數(shù)據(jù)科學(xué)直觀(guān)的解析了后期關(guān)于Zfp217與YTHDF2相互作用以使FTO 能與m6A結(jié)合 ，從而增強(qiáng)了FTO對(duì)m6A RNA的定位和去甲基化酶活性（圖1）。

 

 

 

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究首次證明了Zfp217在脂肪生成中的復(fù)雜作用。Zfp217與m6A去甲基化酶FTO的啟動(dòng)子直接結(jié)合，并與m6A“閱讀器”蛋白YTHDF2相互作用，從而增強(qiáng)了FTO對(duì)m6A RNA的去甲基化酶活性。最終，Zfp217以依賴(lài)于m6A-YTHDF2的方式促進(jìn)脂肪生成（圖3）。

 

 

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