酶標(biāo)記抗體或抗原


    酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。


    1.戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡(jiǎn)便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。


    2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。

    按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中酶活性測(cè)定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡(jiǎn)便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。


  3.標(biāo)記抗體鑒定：通常采用棋盤滴定法進(jìn)行篩選。