嚙齒動物固定的目的是為了快速且均勻地將組織保持于特定的生存狀態(tài)。雖然將組織直接放置在固定液中可以很好地用于小塊組織的固定。但是像完整大腦，心臟這樣的較大樣本會引起浸入式固定的問題，因為固定液并不會以相同的速率到達組織的所有區(qū)域，而組織往往在固定液進入前即發(fā)生缺氧反應(yīng)。利用循環(huán)系統(tǒng)直接灌注固定液的優(yōu)點是化學物質(zhì)可以使用天然的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)快速到達生物體的各個角落以達到整體固定的效果。我們尋找的方式就是介紹一種低成本，快速，可控和統(tǒng)一的固定方法，使用4％多聚甲醛通過血管系統(tǒng)灌注以獲得大鼠大腦最好的固定。此方法視頻由密歇根大學生物醫(yī)學工程系Gregory J. Gage等人制作。

以下為具體實驗方法：

1.準備固定液

2.準備灌注緩沖液

3.準備儀器和麻醉

3.1通過水浴加溫將灌注緩沖液加溫至37°C。將出口閥放入裝有緩沖液的燒杯中。用緩沖液填充50 ml注射器并連接到固定管。通過排出緩沖液反復沖洗管道。

 

3.2用緩沖液反復沖洗管道。直到管道中的所有氣泡都被排出。

3.3取下注射器并連接4％多聚甲醛固定液（室溫）容器。為了避免管端處的氣泡，在將管定位到容器中的同時擠壓管排出氣泡。

3.4關(guān)閉出口（針頭端）。將緩沖閥（藍色）轉(zhuǎn)到與固定閥（白色）相同的位置。使緩沖液得以流出。

 

3.5打開出口端口并重復步驟3.1至3.3以填充緩沖液。并消除所有氣泡。

3.6利用橡膠泵使測試系統(tǒng)中保持灌注所需的一定壓力。

3.7在系統(tǒng)中安裝所需設(shè)備，方便操作。

 

3.8在手術(shù)之前，通過腹膜內(nèi)注射（給予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物維持麻醉。

4.手術(shù)灌注

4.1一旦動物到達手術(shù)所需的麻醉程度，將其放在裝滿碎冰的淺盤上。

4.2在肋骨下方的體表和腹壁做一個5-6厘米的側(cè)切口。小心地將肝臟與隔膜分開。

4.3使用彎曲的鈍剪刀在隔膜上做一個小切口。

4.4沿著肋骨的整個長度繼續(xù)隔膜切口以暴露胸膜腔。
4.5沿著肋骨的一側(cè)放置彎曲的鈍剪刀，小心地移動肺部，并通過肋骨切割至鎖骨。在對側(cè)進行類似的切割。
4.6抬起胸骨，仔細修剪連接心臟的組織。用止血鉗夾住胸骨尖端，將止血鉗放在頭上。

 

4.7使用虹膜剪刀在左心室后端做一個小切口。

4.8將15號鈍頭或橄欖尖灌注針穿過切開的心室進入升主動脈。

4.9使用止血鉗夾住心臟，這可以固定針頭并防止泄漏。

4.10使用虹膜剪刀在動物的右心房切開，以盡可能大的出口，而不會損壞降主動脈。此時動物即準備好灌注。

5.灌注

5.1打開灌注系統(tǒng)并將出口連接到針座，注意不要引入任何氣泡。

5.2將壓力計顯示壓力快速均勻地抽吸至80mm Hg。

5.3調(diào)整針角以實現(xiàn)最大流速。

 

5.4一旦緩沖液灌注幾乎完成（200毫升），切換緩沖閥（藍色）至固定液。

5.5當固定開始幾秒鐘內(nèi)可觀察到固定震顫，即為固定開始。

5.6壓力逐漸增加至最大130 mm Hg，以保持穩(wěn)定的流速。

 

5.7一旦固定液接近完成，關(guān)閉出口閥。完成灌注。

5.8完成灌注后，大鼠應(yīng)為僵硬狀態(tài)。

5.9根據(jù)要求處理所用緩沖液及灌注液。

6.解剖

6.1利用剪刀取下頭部。

 

6.2從頸部到鼻子沿著體表做一個中線切口，露出顱骨。
6.3修剪剩下的頸部肌肉，露出顱底;使用剪刀或咬骨鉗去除任何殘留的肌肉。

6.4將一把虹膜剪刀的尖端放在一側(cè)的枕骨大孔上，小心地沿著頭骨的內(nèi)表面滑動剪刀。
6.5切割延伸到后顱骨表面的遠端邊緣。在對側(cè)進行相同的切割。使用咬骨鉗清除小腦周圍的頭骨。
6.6當尖端從背側(cè)遠端后角移動到顱骨的遠端前緣時，小心地沿著顱骨內(nèi)表面滑動剪刀，在切割時抬起刀片以防止損壞大腦。
6.7使用咬骨鉗將顱骨的背面剝離遠離大腦。使用咬骨鉗修剪頭骨的兩側(cè)。
6.8使用刮刀，切斷嗅球和沿大腦腹面的神經(jīng)連接。

6.9輕輕地將大腦從頭部取出，修剪大腦連接到頭骨的硬骨膜。
6.10取出大腦并將其放入一瓶含有至少10倍于大腦本身體積的固定液中。并適時地轉(zhuǎn)動小瓶。

7.后固定及儲存

7.1將大腦置于4°C固定液中24小時并適時轉(zhuǎn)動。

7.2 24小時后用3倍存儲液的磷酸鹽緩沖液清洗大腦并適時轉(zhuǎn)動。

7.3可將腦保存在4°C磷酸鹽緩沖液或含有疊氮化鈉的HBHS中。

8.灌注效果

 

灌注成功的最初指標是實驗動物的四肢的顏色及僵硬度。大腦的大體檢查顯示血管無血液。在用于染色和組織切片中也是如此。灌注結(jié)果的最終指標是組織中超微結(jié)構(gòu)的狀況。