動物實(shí)驗(yàn)給藥劑量的確定，想必是很多同學(xué)都會煩惱的問題。如對于未接觸過藥理的生物系同學(xué)來說常常會盲目追求藥效，導(dǎo)致設(shè)計(jì)劑量過高，甚至超過毒性實(shí)驗(yàn)劑量，殊不知這樣的結(jié)果其實(shí)沒有任何臨床參考意義；但若劑量偏低，又看不到藥物療效，因此在進(jìn)行藥物研發(fā)時(shí)，我們必須同時(shí)考慮藥物的有效性和安全性，找到確保安全條件下的最佳藥效的劑量范圍。那下面我們就看看這個(gè)劑量是如何確定的呢？

合適的動物給藥劑量，其實(shí)是不斷摸索的過程，起初它不是某個(gè)具體數(shù)字，而是通過初步設(shè)計(jì)范圍，然后通過多種實(shí)驗(yàn)的探究，去圈定最合適的區(qū)間或某個(gè)數(shù)值。

一、首先，我們需要了解與藥物研發(fā)密切相關(guān)的幾種動物實(shí)驗(yàn)

藥物的有效性和安全性是評價(jià)藥物的最重要的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，因此藥物研發(fā)階段，藥效和毒性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)必不可少，主要分為以下幾類：

1. 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

• 定義：藥效學(xué)即藥物效應(yīng)動力學(xué)，研究藥物對機(jī)體的作用及作用機(jī)制。內(nèi)容包括觀測生理機(jī)能的變化、測定生化指標(biāo)的變化及觀測組織形態(tài)變化。

• 目的：確定藥物的治療作用及一般藥理作用，為新藥臨床實(shí)驗(yàn)提供可靠依據(jù)。

2. 急性毒性實(shí)驗(yàn)

• 定義：急性毒性是指24 h內(nèi)單次或多次大劑量給予某藥物所出現(xiàn)的有害作用，亦指機(jī)體一次性大劑量接受某種藥物后所產(chǎn)生的快速而劇烈的中毒反應(yīng)，包括死亡效應(yīng)。

• 目的：①測定藥物的半數(shù)致死量 (LD₅₀) 及相關(guān)參數(shù)，初步估計(jì)該藥物毒性大�。虎谕ㄟ^觀察藥物的急性中毒癥狀，推測其毒性靶器官，為毒性作用機(jī)制分析及臨床毒副反應(yīng)監(jiān)測提供依據(jù)；③為多次重復(fù)給藥或長期毒性試驗(yàn)提供劑量設(shè)計(jì)參考。

3. 長期毒性實(shí)驗(yàn)

• 定義：長期毒性是指藥物以一定的等級劑量連續(xù)多日給予受試動物所產(chǎn)生的有害作用，為觀察這種有害作用而設(shè)計(jì)的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。其與急性毒性實(shí)驗(yàn)的根本差異在于給藥的期限、劑量范圍不同，所觀察的毒性效應(yīng)不同。

• 目的：通過重復(fù)的動物實(shí)驗(yàn)表征受試藥物的毒性作用，預(yù)測其可能對人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)。

二、進(jìn)而明確上述三種實(shí)驗(yàn)各自劑量設(shè)計(jì)策略

在給藥劑量探究中，上述3種實(shí)驗(yàn)又有各自的劑量設(shè)計(jì)原則，如下：

1. 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量策略  

a. 根據(jù)文獻(xiàn)預(yù)估劑量

查閱文獻(xiàn)中是否有相似藥物的給藥劑量，如果結(jié)構(gòu)相似、用途相似，或者處方相似、提取工藝相似，則可作為參考，估算受試藥物的合理劑量范圍。

b. 參考該藥物在其他動物身上的使用量

若該藥物在其他物種動物身上使用，可根據(jù)不同動物品系對藥物的耐受性進(jìn)行劑量換算。

如人與動物的耐受性差異較大，動物的耐受性要比人大，也就是動物的單位體重用藥量比人要大。若按單位體重的劑量來算，大鼠、小鼠的等效劑量分別相當(dāng)于人的6.3倍和9.1倍。如下表為人與大鼠、小鼠按體表面積折算的等效劑量比值：

c. 根據(jù)急毒的LD₅₀和長期毒性的劑量設(shè)計(jì)

通過急毒實(shí)驗(yàn)的藥物的半數(shù)致死量LD₅₀的值，可用其1/10、1/20、1/30或1/40等相似劑量作為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的高、中、低劑量組；原則是藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的劑量不應(yīng)高于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量。

d. 根據(jù)預(yù)期量進(jìn)行設(shè)計(jì)

若無相應(yīng)參考，我們可使用初始低劑量，若動物也沒有中毒的表現(xiàn)(體重下降、精神不振、活動減少或其它癥狀)，則可繼續(xù)按照2倍、3.3倍或者5倍劑量遞增，加大劑量。一般2~4次可達(dá)到預(yù)期劑量；如出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，作用也明顯，則應(yīng)減少劑量再次實(shí)驗(yàn)。藥物的初始劑量一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，且動物種屬、給藥途徑不同，初始劑量也不同，如小鼠口服給藥劑量定為10 mg/kg，靜脈給藥劑量定為1 mg/kg。

2. 急性毒性實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)策略

急性毒性實(shí)驗(yàn)主要是初步估計(jì)該藥物毒性大小，一般常用于獲取測定藥物的半數(shù)致死量 (LD₅₀)，為藥效范圍作出參考。測定LD₅₀時(shí)的劑量設(shè)計(jì)主要分為以下兩種情況：

a. 已知化學(xué)類別

通過文獻(xiàn)檢索，為已知化學(xué)類別的受試藥物確定預(yù)期毒性中值（即該類別其他已知化合物的LD₅₀），然后以此值為中間劑量，按一定的組間距（i 值，劑量的對數(shù)差值）（劑量組呈等比分布）上下各推兩個(gè)劑量，作為預(yù)實(shí)驗(yàn)的劑量分組。

預(yù)試時(shí)，組間距可稍大些，i 值可取0.6，相鄰劑量比為1:4。例如：毒性中值為10 mg/kg，則其對數(shù)值為1，組間距 i 為0.6，那么往上推一個(gè)劑量的對數(shù)即為1.6，然后求其反對數(shù)得40 mg/kg；而往下推一個(gè)劑量的對數(shù)即為0.4，求其反對數(shù)得2.5 mg/kg。

同理，再推算出其他的劑量組即可。如果估計(jì)受試藥物的致死劑量范圍較窄，組間距可適當(dāng)縮小，i值取0.2，相鄰劑量比為1:1.6。

通過上述預(yù)實(shí)驗(yàn)找出受試藥物使10%~90%實(shí)驗(yàn)動物死亡劑量的大致范圍，再據(jù)此確定正式實(shí)驗(yàn)的具體分組方案，此時(shí)可按照下式求算組間距：

或

式中，LD₉₀、LD₁₀或LD₁₀₀、LD₀均為預(yù)實(shí)驗(yàn)中求得的LD值；i 為組間距；n為劑量組數(shù)。上述公式求得的i值加上最低劑量組（第一組可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的LD₁₀或LD₀）劑量的對數(shù)值即得第二組（次低劑量組）劑量的對數(shù)值，以此類推至最高劑量組（n組），求出各值的反對數(shù)即得各劑量組的實(shí)際劑量數(shù)值。

b. 對于全新結(jié)構(gòu)的受試藥物或中草藥復(fù)方

可先通過少量動物的摸索，找出0%及100%估計(jì)致死量（及D_min和D_max），再求出i值，具體步驟如下：

1. 先用10倍稀釋的藥物濃度系列，用少量動物（每組2~3只），找出大致死亡范圍；

2. 再用1、2、4、8等2倍稀釋的藥物濃度每組4只動物尋找。

本法可用較少的動物和藥物，確定了D_max和D_min后，可按與前述相近的方法求得組間距。更多注意事項(xiàng)及問題請參考袁伯俊、王治喬老師主編的《新藥臨床前安全性評價(jià)與實(shí)踐》[1]。

3. 長期毒性實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)[2]

長期毒性實(shí)驗(yàn)一般至少設(shè)高、中、低三個(gè)劑量給藥組和一個(gè)溶媒（或輔料）對照組，必要時(shí)還需設(shè)立空白對照組或陽性對照組。理論上群體中毒性反應(yīng)的發(fā)生率隨著藥物在體內(nèi)暴露量的增加而增加，所以：

• 高劑量原則上應(yīng)使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，甚至出現(xiàn)個(gè)別動物死亡，但死亡數(shù)不得超過總數(shù)的20%；

• 中劑量組應(yīng)相當(dāng)于藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的高劑量，應(yīng)使實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生輕微或中等程度的毒性反應(yīng)；

• 低劑量原則上應(yīng)高于整體動物最佳藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的有效劑量，并使動物不出現(xiàn)毒性反應(yīng)；

• 空白對照組應(yīng)給予溶媒或其他賦形劑；

• 正常對照組應(yīng)口服或注射等容量生理鹽水。

下面介紹幾種常用的長期毒性實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)方法[3]：

1. 半數(shù)致死量法（LD₅₀法）

根據(jù)藥物急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)測定的LD₅₀值決定三個(gè)組的劑量。對大鼠而言，高、中、低三個(gè)劑量組可使用1/10、1/50、1/100的LD₅₀值；對犬而言，高、中、低三個(gè)劑量組可使用1/20、1/25、1/50的LD₅₀值。此法為粗略估計(jì)，差異較大，一般只作預(yù)測的參考。當(dāng)急性毒性實(shí)驗(yàn)和長期毒性實(shí)驗(yàn)為同一種動物時(shí)，參考價(jià)值相對大一些；反之，如LD₅₀為小鼠，那么在劑量設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮種屬差異，并按照相關(guān)折算系數(shù)進(jìn)行校正。

2. 藥代動力學(xué)法（MBS法）

根據(jù)藥物代謝動力學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照最大有效安全濃度 (MCD)，大鼠的長期毒性實(shí)驗(yàn)中，低、中、高三個(gè)劑量可分別使用大鼠的1.0 MCD、3.3~6.6 MCD和10~20 MCD；對犬而言，低、中、高三個(gè)劑量可分別使用0.5 MCD、1.65~3.3 MCD、5~10 MCD。此法有參考價(jià)值，但也要注意動物的異同性，尤其是參考小鼠的藥代動力學(xué)結(jié)果時(shí)更應(yīng)慎重。

3. 最大耐受量法（MTD法）

根據(jù)大鼠急性毒理的最大無癥狀劑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在長期毒理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對大鼠而言，高、中、低三個(gè)劑量可分別使用1 MTD、1/3 MTD、1/10 MTD作為實(shí)驗(yàn)劑量；對犬和猴而言，高、中、低三個(gè)劑量可分別使用大鼠的1/2 MTD、1/6 MTD、1/20 MTD作為實(shí)驗(yàn)劑量，也可參考犬或猴單次給藥的MTD。

4. 臨床擬用劑量法（ACD法）

根據(jù)同類型藥物或國外資料或臨床擬用劑量推算，一般長期毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，大鼠高、中、低三個(gè)劑量可使用50~100倍、25~50倍、10~20倍的臨床劑量作為實(shí)驗(yàn)劑量；犬長期毒性實(shí)驗(yàn)的高、中、低三個(gè)劑量可使用30~50倍、15~25倍、5~10倍的臨床劑量作為實(shí)驗(yàn)劑量；對猴而言，可采用與狗相近的劑量或者略低于狗的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此法參考價(jià)值較大，也較常用。

5. 等效劑量法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物與人的等效劑量比值，再按照一定的倍數(shù)擴(kuò)大設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量。此法參考價(jià)值較大，尤其是對抗腫瘤藥、鎮(zhèn)痛藥和外用藥更有意義。

三、了解了三種實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)后，一般我們拿到一個(gè)新藥后，具體如何實(shí)踐呢？

從體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一種藥效可觀的分子后，我們需要將上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來，并最終確定合適劑量！新藥評價(jià)的原則是“安全、有效、可控”，所以一般會以毒性作為首要評價(jià)指標(biāo)，當(dāng)然藥效也十分重要。

1. 首先做急性毒性學(xué)實(shí)驗(yàn)：急毒實(shí)驗(yàn)可以初步估計(jì)該藥物毒性大小，獲得藥物的半數(shù)致死量 (LD₅₀)，為藥效范圍作出參考。一般對于全新結(jié)構(gòu)的藥物，先用少量小鼠摸索中毒劑量或致死劑量，然后用中毒劑量或致死劑量的可取1/10-1/5作為應(yīng)用劑量；若毒性太大，可沒太大必要進(jìn)行下一步的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2. 進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)：一般可根據(jù)毒性試驗(yàn)的LD₅₀進(jìn)行設(shè)計(jì)，可用其1/10、1/20、1/30或1/40等相似劑量作為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的高、中、低劑量組。觀察藥效的同時(shí)，可以相應(yīng)地觀察一些可能出現(xiàn)的副作用，比如說對造血系統(tǒng)的影響，肝腎毒性燈，為長期毒性實(shí)驗(yàn)的觀察項(xiàng)目提供一些參考。

3. 長期毒性實(shí)驗(yàn)：考慮到長期毒性試驗(yàn)周期較長，可放在最后一步進(jìn)行，具體劑量設(shè)計(jì)方法參考上面資料。

當(dāng)我們進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)后，一般情況下，合適的給藥劑量應(yīng)該結(jié)合長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。原則是藥效的高劑量應(yīng)低于長期毒性實(shí)驗(yàn)的中劑量或低劑量；特殊情況下，藥效實(shí)驗(yàn)劑量可適當(dāng)提高，但不應(yīng)超過長期毒性實(shí)驗(yàn)的高劑量。通過逐步縮小范圍，這樣我們就可以得到安全條件下的最佳藥效的給藥劑量了。

以上方法是前人在一定條件下對某些藥物或化合物的藥效或毒性研究中摸索和總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)，有一定的參考價(jià)值。但是我們必須認(rèn)識到，藥物或化合物千差萬別，都要先對具體藥物進(jìn)行認(rèn)真而細(xì)心地分析并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，這樣可以大大地節(jié)約人力、物力和財(cái)力，提高效率，起到事半功倍的作用。 

參考文獻(xiàn)：

[1] 袁伯俊，王治喬. 新藥臨床前安全評價(jià)與實(shí)踐 [M]. 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 1997.

[2] 周立國. 藥物毒理學(xué)（第二版）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2009.

[3] 向明，季暉. 藥物毒理學(xué)（第三版）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015.