肺癌是中國乃至全球最惡性的腫瘤，在各類腫瘤中的發(fā)病率及死亡率一直位居第一，成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。同時(shí)，肺癌也是臨床研究的重要領(lǐng)域，每年與肺癌相關(guān)的SCI論文超過萬篇，其中肺癌動(dòng)物模型已逐漸成為其機(jī)制研究及藥物研發(fā)必不可少的工具。本期有幸邀請(qǐng)到了有多年經(jīng)驗(yàn)的博士師兄，為大家介紹在研究中經(jīng)常用到的幾種肺癌動(dòng)物模型。

肺癌發(fā)病率和死亡率

2017年2月4日，國家癌癥中心公布的最新數(shù)字顯示，在中國惡性腫瘤發(fā)病率為270.59/10萬，死亡率為163.83/10萬，其中肺癌為發(fā)病率、死亡率雙率第一，每年約59.1萬人死于肺癌，其中男性居多，約40.2萬。

同樣在美國，2017年1月5日，美國癌癥協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)表明，如下表所示，在美國男性和女性中肺癌的致死率依然是位居第一［1］。

圖1. 美國癌癥發(fā)病率和死亡率

肺癌細(xì)胞的分類

根據(jù)肺癌的分化程度和形態(tài)特征，目前肺癌主要分為兩大類，即非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，前者主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌［2］。

常見的肺癌模型

肺癌模型主要分為CDTX肺癌細(xì)胞移植模型（皮下移植模型和原位移植模型），PDTX（人源腫瘤組織異種移植模型）和基因修飾的肺癌模型，下面依次介紹。

一、CDTX肺癌細(xì)胞移植模型

肺癌模型中，根據(jù)接種部位主要分為皮下和原位移植模型，在這類模型中需要選擇正確的肺癌細(xì)胞株，可以參考上表中肺癌細(xì)胞分類，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇正確的荷瘤模型，如皮下荷瘤主要用于單獨(dú)研究腫瘤生長(zhǎng)情況。

1. 皮下荷瘤

定義：根據(jù)研究的肺癌類型及基因突變情況，選取狀態(tài)好的腫瘤細(xì)胞移植于小鼠皮下。例如，我們研究KRAS突變的肺癌，通常選取KRAS突變的A549細(xì)胞，細(xì)胞量為1x10⁶－3x10⁶/只。具體的操作視頻和分組請(qǐng)參考往期內(nèi)容（3.8 移植性腫瘤模型的建立之皮下荷瘤），此處不再贅述。

2. 原位荷瘤

定義：將腫瘤細(xì)胞通過注射等方式移植到模式動(dòng)物肺部構(gòu)建的動(dòng)物模型。

模型優(yōu)點(diǎn)：與皮下荷瘤模型相比，能更好反映腫瘤在人體內(nèi)的一個(gè)發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程。

實(shí)驗(yàn)操作方法：

1. 細(xì)胞系選擇及準(zhǔn)備工作

   為了便于觀察肺癌細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)情況，選用帶熒光素酶（Luciferase）標(biāo)簽的A549細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549-Luc（10⁶/只）用胰酶消化收集，1×PBS洗兩次，用PBS重懸后與生長(zhǎng)因子減少的Matrigel基質(zhì)膠按1:1的比例混合，每只老鼠注射100µl含1×10⁶個(gè)細(xì)胞的混合懸液；

2. 小鼠的準(zhǔn)備工作

   選取6-8周齡的Balb/c無胸腺裸鼠，置于超凈工作臺(tái)中麻醉，裸鼠由興奮狀態(tài)轉(zhuǎn)為麻醉狀態(tài)后將其以右側(cè)臥位固定，胸腔表面用酒精消毒。

3. 切口位置的選取，確定肺部位置

   確定位置：位于小鼠左側(cè)肋弓下緣以上約1cm處（第四、五肋弓之間），這一部位有兩條縱向較粗的血管，肺部位于這兩條血管之間（視頻中用黑色marker筆標(biāo)注位置）；

   露出肺部：先將表皮剪一約5mm的小口，沿此小口逐步剪開下層皮下及肌肉組織，隔著胸膜可以看到粉色的肺部，肺部會(huì)隨著小鼠的呼吸收縮和擴(kuò)張。

4. 腫瘤細(xì)胞注射

   取混勻的100µl的細(xì)胞懸液，沿著切口對(duì)準(zhǔn)小鼠的左肺緩慢注射，進(jìn)針深度約為3mm，注射結(jié)束后停針5s，左右旋轉(zhuǎn)慢速出針。

5. 小鼠傷口縫合

   將剪開的小鼠表皮進(jìn)行縫合，將小鼠以右側(cè)臥位（使傷口朝上）置于37℃恒溫加熱板上直至小鼠蘇醒，放回原籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，4-6天傷口即可愈合。

視頻：

https://v.qq.com/x/page/y0519t9zogt.html

注意事項(xiàng)：

1. 為什么使用Matrigel？

如果腫瘤細(xì)胞僅用PBS重懸便注射到小鼠肺部，細(xì)胞可能隨肺部氣管快速擴(kuò)散，造成氣管堵塞導(dǎo)致小鼠死亡，使用Matrigel與細(xì)胞混合后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)便可降低小鼠死亡風(fēng)險(xiǎn)。

2. 如何避免出血？

操作過程中要避開較粗的血管，以免流血影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作以及肺部的觀察；并且最好選用胰島素注射器，由于注射器針頭扎入肺部有可能損傷肺部大血管，很容易造成小鼠的死亡，因此注射器最好選用針頭較細(xì)的胰島素注射器。

3. 注意整個(gè)操作過程及手術(shù)器械要保持無菌，以免小鼠感染［3］。

后續(xù)分組和試驗(yàn)分析

分組時(shí)間：一般原位注射一周后，裸鼠肺癌原位模型建成，進(jìn)行分組（n=10）；

如何分組：依據(jù)裸鼠體重腹腔注射相應(yīng)劑量的D-luciferin (Xenogen) 熒光底物（150 mg/kg），將裸鼠放置于麻醉箱中通以2.5%異氟烷/氧，待裸鼠麻醉后轉(zhuǎn)入IVIS廂室中，使其腹面朝下并持續(xù)通以麻醉氣體，注射底物10min后，進(jìn)行熒光成像，測(cè)量各裸鼠肺部初始熒光值，依據(jù)熒光值的大小平均分組。隨后可進(jìn)行給藥等實(shí)驗(yàn)，定期進(jìn)行熒光檢測(cè)。

人道終點(diǎn)：動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定，小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%，平均腫瘤直徑不超過20mm，并且如果出現(xiàn)潰爛，并且嚴(yán)重轉(zhuǎn)移，造成感染或壞死時(shí)，應(yīng)該中止實(shí)驗(yàn)且對(duì)動(dòng)物施行安樂死。

圖2. 肺部原位注射的熒光圖和肺部白光圖[4]

二、PDTX（人源腫瘤組織異種移植模型）

定義：將病人肺癌組織移植到小鼠皮下等部位，主要用于抑制腫瘤生長(zhǎng)（細(xì)胞增殖）的藥物的篩選檢測(cè)，在近年該模型越來越受重視。

模型優(yōu)點(diǎn)：因?yàn)槿∽圆∪说哪[瘤組織，在組織形態(tài)和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同，故這種模型可以更貼近人類腫瘤的生物學(xué)特性。

實(shí)驗(yàn)操作方法：

1）處理新鮮肺癌組織：在無菌條件下的冰上對(duì)新鮮離體的肺癌腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，切成約15mm³（2mm×2mm×3mm）的小塊；

2）首次接種小鼠：將切好的組織碎片用鑷子填入定制的套管針尖端內(nèi)，注射到5-6周NOD/SCID重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠背部皮下，每只老鼠背部可以接種1-2個(gè)位點(diǎn)，每例腫瘤接種2-3只小鼠，此接種過程須在腫瘤標(biāo)本離體后2h之內(nèi)完成，為提高成瘤率腫瘤塊也可混合10% Matrigel進(jìn)行荷瘤；

3）再次傳代：當(dāng)裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)至1000 mm³左右，表示移植成功，對(duì)其處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的原代（F1代）皮下移植小鼠模型進(jìn)行傳代。

1. 剝離皮下腫瘤，部分組織速凍至液氮備用或經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋；

2. 另一部分組織按照上述接種步驟，移植到4-5只裸鼠皮下，建立第二代移植小鼠模型（F2代）；

3. 按照此流程，在裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代3代后，移植瘤的生長(zhǎng)速度開始穩(wěn)定，可進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。

后續(xù)試驗(yàn)分析：

待皮下腫瘤組織長(zhǎng)到一定體積，進(jìn)行分組（n=10），保證最終可獲得6個(gè)以上有效數(shù)據(jù)。

不同處理組的肺癌的PDTX模型［4］

三、基因修飾模型

定義：主要是利用基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9進(jìn)行敲除或插入特定基因，從而誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤的模型。肺癌基因修飾模型主要是KRAS突變誘導(dǎo)肺癌等產(chǎn)生，KRAS突變同時(shí)P53缺失會(huì)加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

模型優(yōu)點(diǎn)：主要用于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程及作用機(jī)制的研究；同時(shí)原癌基因的頻發(fā)突變是腫瘤產(chǎn)生的重要原因之一，因此靶向這部分原癌基因的抗腫瘤藥物篩選是一個(gè)重要方向。

構(gòu)建方法：可以參考我們往期基因編輯小鼠構(gòu)建過程（包括KO,KI,CKO小鼠的構(gòu)建等）

舉例：Lox-STOP-Lox-Kras^G12D Conditional Mouse Model

Ras在人類腫瘤頻發(fā)突變，K-ras的激活突變是肺部腫瘤產(chǎn)生的原因之一。在k-ras locus上敲入了Lox-Stop-Lox-Kras^G12D，通過小鼠鼻腔注入Ad-Cre重組腺病毒，誘導(dǎo)肺中的K-ras^G12D表達(dá)，從而誘發(fā)肺癌［5］。

應(yīng)用：由于其產(chǎn)生的機(jī)制及組織形態(tài)和遺傳特征等方面均與人類K-ras突變腫瘤相似，因此該模型能夠很好的評(píng)價(jià)針對(duì)K-ras突變的抗腫瘤藥物活性［4］。

準(zhǔn)確的肺癌動(dòng)物模型至關(guān)重要，它是獲得正確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和發(fā)表文章的重要前提，本期我們根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)，為大家總結(jié)了3種常見的肺癌模型。隨后，我們會(huì)繼續(xù)介紹其他腫瘤模型的構(gòu)建，所以做其他腫瘤方向的童鞋不要著急，后期內(nèi)容會(huì)越來越精彩。如果您覺得我們的內(nèi)容還不錯(cuò)，快快點(diǎn)擊上方藍(lán)字關(guān)注吧！

參考文獻(xiàn)

［1］Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 2017 Jan;67(1):7-30.

［2］Lung Carcinoma: Tumors of the Lungs. Merck Manual Professional Edition, Online edition. [2007-08-15].

［3］Wang YW, Wang XW, Wei JM, et al. Establishment of NSCLC in situ metas- tasis model using GFP/A549 cells. J Shandong Univer (Health Sciences), 2006, 44(7): 698-702. 

［4］Wang J, Hu K, Guo J, et al. Suppression of KRas-mutant cancer through the combined inhibition of KRAS with PLK1 and ROCK[J]. Nature Communications,2016: 11363-11363.

［5］Michel DuPage, Alison L Dooley & Tyler Jack. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase .Nat Protoc. 2009;4(7):1064-72.