繼上次發(fā)表的Guide RNA設計和篩選的相關知識之后，希望大家還沒有忘記相關的操作和技巧，今天，我們就來和大家聊聊后續(xù)的實驗，在基因編輯鼠的過程中，sgRNA表達載體是如何構建的呢？

在靶點篩選結束之后，下一步就要進行sgRNA載體構建。在構建表達載體前，應根據(jù)實驗目的選取合適的表達質(zhì)粒。比如進行實驗時考慮是否需要reporter標簽，是否需要藥物篩選基因等。

接下來以構建px330質(zhì)粒為例，具體說明如何構建sgRNA表達載體。（圖1）

1. 先確定20bp靶標序列（基因組序列應為20bp+NGG）；

2. 如20bp第一個為G，則略過此部分；在20bp前額外添加一個G，形成G+20bp序列（U6 human promoter轉錄時需要起始堿基為G）；

3. 在20bp或G+20bp 5’前添加caccg，形成cacc-G+20bp序列，則為Forward序列（直接合成即可）；

4. 將20bp或G+20bp 進行反向互補，并在5’前添加aaac，則為Reverse序列（直接合成即可）；

5. 合成的sgRNA正反向堿基（摩爾濃度為100μM）進行退火，使之堿基配對并形成雙鏈結構；

6. BbsI酶切px330質(zhì)粒，并對酶切后的載體進行回收；

7. 將退火配對后的sgRNA堿基用超純水按1:200稀釋，并與回收后的載體進行連接；

8. 連接產(chǎn)物進行轉化，氨芐抗性固體培養(yǎng)板進行涂板；

9. 挑取單克隆菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并使用human U6通用引物對連接載體進行測序，檢測sgRNA 堿基片段是否正確插入px330質(zhì)粒。

圖1.px330 sgRNA表達載體構建示意圖

然而，在進行受精卵顯微注射時為了增加基因編輯的效率，一般以RNA形式替代DNA質(zhì)粒形式。以下為構建sgRNA體外轉錄載體pGS3-T7-sgRNA步驟。（圖2）

1. 確定20bp sgRNA靶序列，按上述操作將其連接至BbsI酶切的pGS3-T7-sgRNA中，測序并挑選正確插入的質(zhì)粒；

2. pGS3-T7-sgRNA質(zhì)粒線性化：用DraI酶切1μg pGS3-T7-sgRNA質(zhì)粒，37℃反應3h；

3. 以構建正確的pGS3-T7-sgRNA為模板，配制體外轉錄反應溶液（體系見表1）；

4. 將上述溶液均勻混合后輕微離心，將轉錄反應液收集于反應管底部，42℃反應 2 小時；

5. 加3μl RNase-Free DNase I至20μl反應體系中，充分混合后置于37℃反應30min；

6. 加77μl RNase-free 純水以終止反應繼續(xù)進行；

7. 使用酚氯仿和異丙醇方法純化轉錄后的RNA；

8. 取反應液的一部分進行4% 瓊脂糖凝膠電泳，確認體外轉錄后的 RNA 產(chǎn)物；

9. 測定RNA濃度，用以顯微注射。 

   
   圖2. pGS3-T7-sgRNA載體構建及體外轉錄示意圖

   試劑	用量
   Transcription buffer ,10 x	2μl
   Template DNA ,200ng/μl	5μl
   ATP ,50mM	2μl
   GTP ,50mM	2μl
   CTP ,50mM	2μl
   UTP ,50mM	2μl
   Rnase inhibitor ,40U	0.5μl
   RNA polymerase , 50U	2μl
   RNase-free H2O	2.5μl

表1. sgRNA T7-體外轉錄反應體系

Cas9表達載體體外轉錄步驟。（圖3）

1. pSP6-Cas9質(zhì)粒線性化：用NotI單酶切5μg pSP6-Cas9質(zhì)粒，37℃反應5h；

2. 0.8%或1%瓊脂糖凝膠電泳，并進行DNA凝膠純化回收，測定濃度；

3. 以純化DNA為模板，按mMessage mMachine SP6體外轉錄試劑盒說明書配制反應溶液（體系見表2）；

4. 將上述溶液均勻混合后輕微離心，將轉錄反應液收集于反應管底部，37℃反應 2 h；

5. 加1μl TURBO DNase至反應溶液中，混勻并在37℃反應15min；

6. 加30μl nuclease-free 純水及30μl 氯化鋰溶液，混勻溶液并在-20℃冷凍30min；

7. 4℃、14,000g離心10min以沉淀mRNA，小心去除上清溶液。并用500μl 70%乙醇清洗一遍，同時再次4℃、14,000g離心10min；

8. 吸凈上清乙醇溶液，室溫干燥5min，最后用20μl RNase-free 純水溶解mRNA沉淀，混勻后置冰上并測定濃度，最后置于-80℃或-150℃保存。

 

圖3. pSP6-Cas9載體構建及體外轉錄示意圖

試劑	用量
Transcription buffer ,10 x	2μl
Template DNA ,200ng/μl	5μl
SP6 NTP/CAP ,2 x	2μl
SP6 enzyme mix	2μl
RNase-free H2O	9μl

表2. Cas9 mRNA SP6-體外轉錄反應體系

參考文獻：

Shao Y et al., CRISPR/Cas-mediated genomeediting in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nat Protoc. 2014Oct;9(10):2493-512.