2013年，一種名為的“CRISPR”的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)后，“基因編輯”這個詞匯不經(jīng)意間火了，傳遍了整個學(xué)術(shù)圈、生活圈，甚至是朋友圈。它的出現(xiàn)讓“編輯生命”變得觸手可及，它似乎可以斗過癌癥（白血�。┖桶�滋病，還有各種遺傳病。

我們知道，目前這些人類疾病都沒有辦法從根本上治療，而它們幾乎都和基因突變相關(guān)�；�因編輯的出現(xiàn)為我們?nèi)祟惤】祹�來巨大的福音，與此同時，基因編輯的小鼠日漸成為不可忽視的大明星，為人類疾病臨床前研究作出了不可估量的貢獻(xiàn)。本期的內(nèi)容就是一起看看基因編輯小鼠如何一步步成長并成為我們必不可少的研究工具。

一、基因編輯小鼠定義

基因編輯小鼠：利用基因編輯的方法改變小鼠目的基因片段，實(shí)現(xiàn)對特定基因片段進(jìn)行敲除，引入突變或外源基因等，從而獲得基因修飾的小鼠，主要分為基因敲除（KO）、基因敲入(KI)、條件性敲除小鼠(CKO)等。

二、基因編輯小鼠重大意義

由于疾病包括癌癥、罕見�。�β-地中海貧血、肌肉萎縮癥等）都與基因突變有關(guān)，基因編輯構(gòu)建的疾病模型已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的工具。

1.基因功能研究

基因編輯的小鼠，被廣泛應(yīng)用于研究基因在小鼠中的功能，由于小鼠與人有90%同源基因，因此這些基因功能可以類推至人類身上。比如對于P53基因敲除鼠的研究讓我們確認(rèn)了這一著名的抑癌基因的功能。

2.疾病機(jī)理研究

利用基因編輯在小鼠身上模擬人類疾病，是一條研究疾病機(jī)制的捷徑。苯丙尿酮癥是一種苯丙氨酸代謝障礙導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病，有較高發(fā)病率，且對患兒有極大傷害。在PAH基因第12外顯子敲除2bp（PAH^416STOP）或?qū)�PAH蛋白序列408位精氨酸替換為色氨酸（PAH^R408W）可以構(gòu)建典型的苯丙尿酮癥小鼠，多用于發(fā)病機(jī)制與治療手段的研究。如下圖為敲除鼠毛色減退，并且血苯丙氨酸含量高于野生型小鼠。

 

3.藥物研發(fā)的重要工具

通過基因改造使基因敲除或添加的小鼠，成為癌癥、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮癥和帕金森氏癥等一系列人類疾病的關(guān)鍵研究模型。我們利用基因修飾的疾病模型，開發(fā)藥物或者采用基因編輯技術(shù)修復(fù)突變基因，從而治愈疾病成為可能。2016年劉明耀教授課題組就利用CRISPR/Cas9技術(shù)治愈了F9突變小鼠的B型血友病。

三、基因編輯技術(shù)小鼠變得日益簡單

自首個轉(zhuǎn)基因小鼠在1974年由Rudolf Jaenisch培育出后，Jackson Lab和其他實(shí)驗(yàn)室一直在致力于基因小鼠的構(gòu)建，然而其步驟繁瑣，辛苦費(fèi)力，涉及利用基因工程技術(shù)改變小鼠的胚胎干細(xì)胞，將其注射進(jìn)胚胎，并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團(tuán)隊(duì)，也要用2年時間才能成功改造一只小鼠。而CRISPR的出現(xiàn)，顛覆了所有的一切，它能在6個月內(nèi)就產(chǎn)生基因修飾的的小鼠。

基因編輯技術(shù)小鼠發(fā)展歷程

1.ES基因打靶技術(shù)

出現(xiàn)時間：1987年，Capecchi和Smithies根據(jù)染色體同源重組的原理，在小鼠胚胎干細(xì)胞（mES）水平首次實(shí)現(xiàn)了外源基因的定點(diǎn)整合，這就是廣為人知的ES基因打靶技術(shù)。

原理：利用基因打靶獲得的陽性ES細(xì)胞再經(jīng)過胚胎顯微注射，最終就可以得到基因敲除/敲入小鼠。

優(yōu)勢：作為早期的基因編輯技術(shù)，克服了隨機(jī)整合的盲目性和危險(xiǎn)性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。尤其是條件性、可誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對基因靶位點(diǎn)在時間和空間上的調(diào)控更加精確。

缺點(diǎn)：基因打靶依賴于DNA同源重組修復(fù)機(jī)制，效率非常低（1/10⁶）；并且通過ES基因打靶獲得目的基因修飾的小鼠周期很長。

2.人工鋅指核酸酶—ZFN

出現(xiàn)時間：1996年，Kim等人利用鋅指蛋白融合FokI核算內(nèi)切酶，成功構(gòu)建了人工鋅指核酸酶(zinc Finger Nucleases，ZFNs)。

原理：如下圖，ZFN的DNA識別域由3至4個Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成，每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基。當(dāng)DNA識別域特異結(jié)合到目的基因時，核酸內(nèi)切酶就能夠切割目標(biāo)DNA序列。

優(yōu)點(diǎn)：同傳統(tǒng)的打靶技術(shù)相比較，其效率提高了100倍以上。同時，可通過受精卵顯微注射直接獲得基因修飾小鼠，節(jié)省了大量時間。

缺點(diǎn)：費(fèi)用高昂，工作量大，并且最終產(chǎn)生的ZFNs會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

3.轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶-TALEN

出現(xiàn)時間：2011年科學(xué)家首次把TALE 與FokI 結(jié)合在一起組成轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs),并證實(shí)了TALEN能夠?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行切割。

原理：如下圖，TAL效應(yīng)子可被設(shè)計(jì)識別和結(jié)合所有的目的DNA序列。對TAL效應(yīng)子附加一個核酸酶就生成了TALENs。TAL效應(yīng)核酸酶可與DNA結(jié)合并在特異位點(diǎn)對DNA鏈進(jìn)行切割，從而導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)。

 

優(yōu)點(diǎn)：相比于ZFNs，TALEN的獲取更加簡單方便，花費(fèi)較低，細(xì)胞毒性相對ZFNs較低，因此自出現(xiàn)起就獲得了廣泛應(yīng)用。

缺點(diǎn)：依然有一定的細(xì)胞毒性，且模塊組裝過程復(fù)雜繁瑣，難以實(shí)現(xiàn)多基因和多位點(diǎn)的修飾。

4.規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)

出現(xiàn)時間：CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌或古生菌防御外源核酸（如噬菌體和質(zhì)粒DNA）入侵的一套防御機(jī)制，于2013年被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于基因組修飾。

原理：如下圖，通過設(shè)計(jì)向?qū)�RNA(Guide RNA,gRNA) 序列并將Cas9蛋白引導(dǎo)到基因組的特定位點(diǎn)上，然后通過Cas9 的核酸酶切割活性造成DNA 斷裂。

 

優(yōu)勢：被喻為“魔術(shù)剪刀”，可以高效定點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)基因編輯。相比于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9技術(shù)具有二者無法比擬的可操作性，構(gòu)建時間成本大大降低，并且簡便高效的特點(diǎn)極大地推動了生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，并為根治諸多遺傳疾病帶來了新的希望。

近年來，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，使基因編輯小鼠似乎變得唾手可得，構(gòu)建一只基因編輯小鼠僅需要4-6個月。因此，越來越多的高分文章開始采用該小鼠模型進(jìn)行相關(guān)疾病和基因功能的研究。

所以說，目前不僅僅是牛人開始談?wù)撈鸹�因編輯小鼠，身邊的同學(xué)們也紛紛涌入這類小鼠的研究。所以，想想你的課題需要構(gòu)建此類疾病模型嗎，需要研究某個基因功能嗎？如果需要，那就趕緊擼起袖子干吧，因?yàn)橐磺幸炎兊们八�未有的簡單�?/p>

參考文獻(xiàn)

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