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皮下荷瘤實驗的介紹及應(yīng)用

瀏覽次數(shù):9598 發(fā)布日期:2019-7-16 
腫瘤細(xì)胞系移植模型(CDTX)因易構(gòu)建、成瘤率高、周期短等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用,并且目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是通過該模型而被發(fā)現(xiàn)。本期咱們就首先為大家介紹,CDTX模型中看似最簡單卻深藏多種不確定因素的皮下荷瘤。

皮下荷瘤定義
腫瘤細(xì)胞系移植到同種或異種動物的皮下形成腫瘤塊,荷瘤是將腫瘤細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)的專業(yè)說法,皮下荷瘤屬于腫瘤細(xì)胞系移植模型(CDTX),CDTX還包括各種轉(zhuǎn)移模型荷瘤、原位荷瘤等。

皮下荷瘤應(yīng)用
一般用于抑制腫瘤生長(細(xì)胞增殖)的藥物的篩選檢測。如果單獨研究腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長,那么幾乎所有的腫瘤均可通過皮下荷瘤進(jìn)行實驗研究。

第一部分:皮下荷瘤模型的幾個考慮因素
(1)腫瘤細(xì)胞系的選擇
腫瘤細(xì)胞株的選擇,是一個很麻煩的問題,卻是最重要的問題。有以下幾點要求:
① 不同腫瘤細(xì)胞系的成瘤率不同,需選取成瘤率高的細(xì)胞系;如乳腺癌細(xì)胞MCF-7,雖在體外應(yīng)用多,但體內(nèi)成瘤率差,生長慢,因此一般不選用;
② 腫瘤細(xì)胞根據(jù)分子標(biāo)記分為多種,考慮成瘤率外,選擇時還需考慮實驗?zāi)康模玑槍λ幬锇悬cHER2,需要選擇HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞如SKBR-3,而不是HER2陰性的MDA-MB-231;再如研究靶向kras突變腫瘤的藥物,我們選取kras突變的(其突變類型又屬于突變率比較高的),又易培養(yǎng)且成瘤率好的A549。
③ 實驗用腫瘤細(xì)胞株多為人源或鼠源細(xì)胞系,根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇,一般鼠源細(xì)胞系更易荷瘤,但是人源細(xì)胞系會更貼近人類腫瘤生長情況。
(2)小鼠品系的選擇
由于腫瘤細(xì)胞系主要分為人源和鼠源,因此小鼠品系的選擇要根據(jù)細(xì)胞系來源。
人源細(xì)胞系:為異種移植,應(yīng)該選擇免疫缺陷的小鼠(如:nude,NOD/scid,NSG,詳情點
擊鏈接3.2 免疫缺陷動物(一)。
鼠源細(xì)胞系:為同種移植,選擇與腫瘤細(xì)胞系來源一致的小鼠(C57BL/6品系來源的黑色素
瘤細(xì)胞系B16F10就要選擇C57BL/6品系的小鼠)。不過裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系統(tǒng)
異常,不適用于篩選免疫調(diào)控藥物。
(3)接種部位
應(yīng)選擇血管豐富且易操作的部位,如腋下、腹股溝、側(cè)腹部及頸背部等部位。其中腋下中部皮下較好,成瘤率高。如下圖所示:

Nude裸鼠腋下處皮下荷瘤(人源乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3)
Balb/c小鼠腹股溝皮下荷瘤(鼠源結(jié)腸癌CT26)

第二部分:裸鼠皮下荷瘤步驟
一般更多的時候是選擇人源腫瘤細(xì)胞系,然而由于存在免疫排斥,需選擇裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠為例,為大家詳細(xì)介紹皮下荷瘤的實驗過程
 腫瘤細(xì)胞的傳代擴增
取凍存于液氮的腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇并擴增,確保腫瘤細(xì)胞的活力和良好的生長狀態(tài)
 計算細(xì)胞接種量
根據(jù)經(jīng)驗,一般鼠源腫瘤細(xì)胞接種2~100萬/只,而人源腫瘤細(xì)胞則需要200-1000萬/只以
上。當(dāng)然最好結(jié)合文獻(xiàn)來確定細(xì)胞接種量,在找不到相關(guān)資料的情況下,最高就用到1000
萬/0.1ml,不可再高(因為細(xì)胞懸液已達(dá)飽和狀態(tài))。并且提前計算確定細(xì)胞數(shù)量,一般注射40只小鼠,至少需要準(zhǔn)備50只小鼠的細(xì)胞量。
 準(zhǔn)備裸鼠
一般選擇5-6W裸鼠,小于4W動物可能不耐受而過早死亡,大于6W免疫力會增強,不
易成瘤;
每批實驗只用同一性別動物,通常雌雄均可,但是根據(jù)研究的腫瘤類型及腫瘤細(xì)胞系選擇(乳
腺癌等要選擇雌性,前列腺癌等要選擇雄性)
⑷ 操作步驟(請觀看視頻)
① 接種時選擇好部位進(jìn)針,建議接種前酒精棉球擦拭消毒進(jìn)針位置;
② 向前方穿行,注射前針頭稍微動一動,能動說明在皮下,否則可能在皮內(nèi)或者肌肉內(nèi);
③ 針頭在皮下走一段再注射,速度不可太快,一般體積為100-200μL(PBS或者無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,若不易成瘤可添加matrigel促進(jìn)成瘤),可看見明顯的鼓包;
④ 接種點離進(jìn)針點盡量較遠(yuǎn),減少漏液和污染的可能;
⑤ 注射完畢后,緩慢退出針頭,盡量避免漏液;
⑥ 細(xì)胞需一直置于冰上,使細(xì)胞處于比較低的代謝狀態(tài),一般2h之內(nèi)不會有問題。
下面為皮下荷瘤視頻(包括各個部位的注射手法):
視頻
第三部分:后續(xù)實驗安排
⑴ 分組:一般來說皮下荷瘤主要用于抗腫瘤藥物的檢測,因此我們一般分為對照組,陽性藥物組,低劑量、中劑量及高劑量藥物組等;
⑵ 數(shù)量:荷瘤時每組不少于10只,考慮到小鼠成瘤率和死亡原因,最終實驗應(yīng)至少可以獲取6個有效數(shù)據(jù);
⑶ 給藥時間:一般接種7-10天后便可看到腫瘤長起,便可分組實驗(鼠源細(xì)胞系會更快);
⑷ 人道終點:動物倫理學(xué)規(guī)定,小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%,平均腫瘤直徑
不超過20mm,并且如果出現(xiàn)潰爛,造成感染或壞死時,應(yīng)該中止實驗且對動物施行安樂死。
補充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步驟與裸鼠荷瘤一致,只是比較繁瑣的是,由于野生型小鼠有毛發(fā),所以需要剃毛(如
上圖Balb/c小白鼠腹股溝皮下荷瘤鼠源結(jié)腸癌CT26)
第四部分: 皮下荷瘤的幾點問答
⑴ 瘤子長不出來是怎么回事?
一方面可能是細(xì)胞狀態(tài)差,活力不好,或是腫瘤細(xì)胞不易成瘤,需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系;一方面可能是小鼠周齡太大,或小鼠免疫排斥,建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠(Nod-scid小鼠,NOG小鼠> Nude裸鼠)
⑵ 小鼠瘤子長起來又消失?
腫瘤塊先縮小,后變大很常見,很可能是炎癥反應(yīng),腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收,繼續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞吸收之后是否經(jīng)過幾周還能長出來,長不起來建議換鼠。
⑶ 均一性很差,腫瘤體積差距較大?
如果荷瘤分組發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤體積差距很大,這可能跟小鼠周齡及接種細(xì)胞量不一致導(dǎo)致,建議重新做實驗分組。
⑷ 是否可以在一只小鼠進(jìn)行多個點荷瘤?
不可以,一只老鼠就只能接種一個點。因為一個老鼠身上有多個腫瘤塊的情況下,可能會相互影響。
⑸ 是否應(yīng)用免疫抑制劑加速腫瘤生長?
如果裸鼠荷瘤不生長,可以參考文獻(xiàn),用免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺(抑制裸鼠NK細(xì)胞活性)
促進(jìn)生長;不過最好不要為了縮短造模周期來加速生長,因為可能會造成潰爛,這樣就不得
不中止實驗。所以一般情況下,應(yīng)盡量符合細(xì)胞系本身的生長特性,不應(yīng)過多地人為的干擾。

皮下荷瘤實驗介紹就到此結(jié)束了,原來看似簡單的實驗卻有多種不可忽視的因素需要考慮。
簡單回顧一下,皮下荷瘤模型中細(xì)胞系和小鼠品系是最需要考慮的兩大因素,切記一定要多
查閱文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)實驗,進(jìn)而找到最合適的皮下腫瘤模型。
 
來源:上海邦耀生物科技有限公司
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