靶向序列捕獲和新一代測(cè)序前對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋組織及新鮮冷凍組織進(jìn)行 DNA 質(zhì)量控制

 
作者
Melissa Huang Liu
安捷倫科技有限公司
美國(guó)加利福尼亞州拉霍亞
 
Maria Celeste Ramirez
安捷倫科技有限公司
美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉


摘要
 
本文將介紹利用 Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)的微控流芯片電泳，在新一代測(cè)序工作流程的 SureSelect 靶向序列捕獲之前或期間，對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋組織及新鮮冷凍組織的 DNA 樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。借助 2100 生物分析儀系統(tǒng)可靠的 DNA 電泳技術(shù)，可提供彌散條帶譜及詳細(xì)的文庫(kù)統(tǒng)計(jì)信息，例如峰高、平均彌散條帶分子量、分子量分布和 DNA 濃度。FFPE DNA 樣品的結(jié)果與新鮮冷凍組織和對(duì)照 DNA 的 DNA 分析結(jié)果具有可比性。

前言
 
最常用的臨床樣品保存和存檔方法之一 是制備福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織。全世界的組織庫(kù)、醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)存檔的 FFPE 組織樣本數(shù)超過 4 億個(gè)。組織樣本通過解剖或活檢進(jìn)行收集，然后用福 爾馬林固定以及石蠟包埋以保持其完整性， 用于組織病理學(xué)研究及顯微鏡觀察。收集到的這些病變組織和正常組織未來可能會(huì)成為分子遺傳學(xué)研究中非常有價(jià)值的資源。但是，從 FFPE 樣品中進(jìn)行 DNA 提取面臨巨大的挑戰(zhàn)^[1]。甲醛交聯(lián)、降解以及單鏈和雙鏈 DNA 相混合等常見問題會(huì)導(dǎo)致適合下游應(yīng)用的 DNA 材料數(shù)量減少。因此，對(duì)用于新一代測(cè)序 (NGS) 等高靈敏度、成本高昂的應(yīng)用的樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估顯得 尤為重要。

經(jīng)驗(yàn)證，2100 生物分析儀是 NGS 工作流程中進(jìn)行片段 DNA 和 DNA 文庫(kù)分子量測(cè)定以及定量分析的一個(gè)重要工具^[2]。本文將介紹利用 2100 生物分析儀的芯片電泳技術(shù)對(duì) NGS 靶向序列捕獲工作流程中的
FFPE 和新鮮冷凍 DNA 樣品進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)部分
材料
FFPE 及新鮮冷凍組織的 DNA 由西奈山醫(yī)學(xué)院捐贈(zèng)（美國(guó)紐約州紐約市）， NA10831-1 對(duì)照 DNA 購(gòu)自科里爾研究所（美國(guó)新澤西州卡姆登）。QIAmp DNA FFPE 組織試劑盒購(gòu)自 QIAGEN GmbH（德國(guó)希爾登）。Ambion RecoverAll 總核酸分離試劑盒購(gòu)自 Life Technologies 公司（美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德）。E220樣品前處理系統(tǒng)購(gòu)自 Covaris 公司（美國(guó)馬薩諸塞州沃本）。2100 生物分析儀、安捷倫 DNA 1000 試劑盒，以及安捷倫高靈敏度 DNA 試劑盒均來自安捷倫科技有限公司（德國(guó)瓦爾特布�。�。

樣品前處理
采用 QIAGEN FFPE 組織試劑盒及 Ambion 核酸分離試劑盒提取病人 FFPE 腫瘤組織中的基因組 DNA。所有樣品均采用 SureSelect 靶向序列捕獲實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行進(jìn)一步處理^[3]。

采用芯片電泳進(jìn)行 DNA 質(zhì)量控制
DNA 電泳采用了 2100 生物分析儀，并根據(jù)生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案^[4,5]，聯(lián)用 DNA 1000 試劑盒或高靈敏度 DNA 試劑盒。并在區(qū)域 (Region) 表格中對(duì)彌散條帶的濃度及平均分子量進(jìn)行分析。峰高在色譜峰 (Peak) 表格中進(jìn)行測(cè)定，如 SureSelect 實(shí)驗(yàn)方案中所述^[3]。

結(jié)果和討論
要想成功實(shí)現(xiàn)靶向序列捕獲和 NGS，關(guān)鍵是在樣品前處理工作流程中的特定時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。在本文中，源自病人 FFPE 組織的基因組 DNA (gDNA)、新鮮冷凍腫瘤組織中相匹配的 gDNA，以及對(duì)照細(xì)胞系 DNA 均根據(jù) SureSelect 實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行處理。利用 2100 生物分析儀在一些關(guān)鍵步驟進(jìn)行 DNA 樣品質(zhì)量控制(QC)：剪切后片段化、捕獲前擴(kuò)增及捕獲后擴(kuò)增（圖 1）。
   
剪切后片段化分析
源自 FFPE 樣品的 DNA 采用兩種不同的方法進(jìn)行提取 — QIAGEN FFPE 組織試劑盒 (FFPE DNA Q) 和 Ambion 核酸分離試劑盒(FFPE DNA A)，并與相匹配的新鮮冷凍組織提取的 DNA 及對(duì)照 DNA 進(jìn)行比較。所有樣品均采用 Covaris 系統(tǒng)進(jìn)行片段化。剪切后樣品采用 DNA 1000 試劑盒分析(圖2），結(jié)果顯示各樣品均出現(xiàn) 100 至 450 堿基的彌散條帶。除了分子量及純度信息外，100 生物分析儀還可提供每個(gè)樣品的總 DNA 濃度，并對(duì)特定區(qū)域內(nèi)的彌散條帶定量。
 

圖2. 剪切后的片段分布。使用 Agilent 2100 生物分析儀及安捷倫 DNA 1000 試劑盒分析樣品所得的膠圖及電泳疊加譜圖。樣品：FFPE DNA Q（紅色），F(xiàn)FPE DNA A（藍(lán)色），新鮮冷凍組織
DNA（綠色），對(duì)照 DNA（淺綠色）

捕獲前擴(kuò)增
四個(gè) DNA 樣品按照樣品前處理工作流程（圖 1）進(jìn)行進(jìn)一步處理。對(duì)捕獲前擴(kuò)增樣品進(jìn)行五次 PCR 循環(huán)，然后采用 DNA 1000 試劑盒在 2100 生物分析儀上進(jìn)行分析（圖 3）。
 

圖3. 使用 Agilent 2100 生物分析儀及安捷倫 DNA 1000 試劑盒分析所得的捕獲前擴(kuò)增樣品的電泳疊加譜圖。樣品：FFPE DNA Q（紅色），F(xiàn)FPE DNA A（藍(lán)色），新鮮冷凍組織 DNA（綠色），對(duì)照 DNA（淺綠色）

所有 DNA 樣品的譜圖在大約 100 至 900 堿基之間十分類似。平均分子量為 307 至 348 堿基之間，最大峰高位于 254 至 271 堿基之間（表 1）。未觀察到任何擴(kuò)增假體或引物二聚體。此外，2100 生物分析儀可自動(dòng)提供彌散條帶的 DNA 濃度，其介于 23 至 90 ng/µL 之間。
 

樣品	平均分子量 [bp]	峰高 [bp]	濃度 [ng/µL]
FFPE DNA Q	307	264	34.8
FFPE DNA A	309	254	22.6
冷凍組織 DNA	331	264	89.5
對(duì)照 DNA	348	271	23.2

表 1 捕獲前擴(kuò)增文庫(kù)的平均分子量、峰高及定量

捕獲后擴(kuò)增
SureSelect 實(shí)驗(yàn)方案中的最后一個(gè) DNA QC 步驟需要對(duì)捕獲后樣品進(jìn)行 10 次循環(huán)擴(kuò)增，然后采用高靈敏度 DNA 試劑盒在 2100 生物分析儀上進(jìn)行分析（圖 4）。觀察結(jié)果表明，所有四個(gè)樣品的電泳譜圖較為一致，彌散條帶從 225 至 600 堿基，峰高為 314 至 336 堿基（表 2）。分子量分布及 DNA 文庫(kù)的產(chǎn)量均在 Illumina 末端配對(duì)多重測(cè)序所推薦的范圍之內(nèi)（2 × 76 bp 讀長(zhǎng)）。
 

圖4. 使用 Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)及高靈敏度 DNA 試劑盒分析所得的捕獲后擴(kuò)增文庫(kù)的電泳疊加譜圖。樣品：FFPE DNA Q（紅色），F(xiàn)FPE DNA A（藍(lán)色），新鮮冷凍組織 DNA（綠色），對(duì)照 DNA（淺綠色）
 

樣品	平均分子量[bp]	峰高[bp]	濃度[pg/μl]
FFPE DNA Q	357	316	572.0
FFPE DNA A	348	314	609.4
冷凍組織DNA	376	340	676.3
對(duì)照DNA	382	336	415.2

結(jié)論
 
在 SureSelect 靶向序列捕獲的樣品前處理工作流程中，2100 生物分析儀被應(yīng)用于 FFPE 樣品的 NGS 樣品 QC�？煽康� DNA 芯片電泳可提供彌散條帶譜和詳細(xì)的文庫(kù)統(tǒng)計(jì)信息，例如峰高、平均彌散條帶分子量、分子量分布和 DNA 濃度。FFPE、相匹配的新鮮冷凍組織，以及對(duì)照細(xì)胞系 DNA 所得結(jié)果適用于下游的Illumina 平臺(tái)測(cè)序。

參考文獻(xiàn)
 
1. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.
2. Kirill Gromadski, Rüdiger Salowsky, Susanne Glück, “Improving sample quality for SureSelect target enrichment and next-generation sequencing with the Agilent High Sensitivity DNA kit”（采用安捷倫高靈敏度 DNA 試劑盒提高SureSelect 靶向序列捕獲及新一代測(cè)序的樣品質(zhì)量），安捷倫科技應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)，出版號(hào) 5990-5008EN，2010
3. “SureSelect Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing”
（適用于 Illumina 末端配對(duì)測(cè)序的
SureSelect 靶向序列捕獲系統(tǒng)），安捷倫科技操作手冊(cè)，出版號(hào) G7530-90000， 2012
4. “Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide”
（安捷倫高靈敏度 DNA 試劑盒指南），安捷倫科技操作手冊(cè)，出版號(hào) G2938-90321， 2009
5. “Agilent DNA 1000 Kit Guide”（安捷倫DNA 1000 試劑盒指南），安捷倫科技操作手冊(cè)，出版號(hào) G2938-90014，2006

© 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司，2012
2012 年 6 月 1 日，中國(guó)出版