文章導(dǎo)讀
結(jié)核�。═B，Tuberculosis）是結(jié)核桿菌（Mtb，Mycobacterium tuberculosis）感染導(dǎo)致的疾病。根據(jù)感染部位不同分為肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、骨骼結(jié)核等，這是一種發(fā)病率較高、傳染性較強(qiáng)的疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2016年全球范圍內(nèi)有1040萬(wàn)新病例并且有170萬(wàn)死亡。

云序客戶(hù)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院、附屬上海市肺科醫(yī)院戈寶學(xué)教授實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事圍繞肺結(jié)核預(yù)防和診治開(kāi)展基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，通過(guò)在我司做的miRNA測(cè)序不久前發(fā)表文章報(bào)道了新結(jié)核病的易感基因，為結(jié)核病的診斷和治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：12.35
實(shí)驗(yàn)方法：miRNA測(cè)序

1. Mtb誘導(dǎo)miR-27a表達(dá)
為探索結(jié)核菌感染發(fā)病新機(jī)制，作者分別對(duì)正常人和肺結(jié)核患者外周血、結(jié)核菌感染的小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肺組織、巨噬細(xì)胞進(jìn)行miRNA測(cè)序（云序提供此服務(wù)），分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌感染會(huì)顯著上調(diào) miR-27a的表達(dá)。

圖1. Mtb誘導(dǎo)miR-27a表達(dá)

2.miR-27a通過(guò)抑制細(xì)胞自噬促進(jìn)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活
那miR-27a的高表達(dá)對(duì)Mtb有什么作用呢？作者接下來(lái)分別用miR-27a-M（miR-27a的模擬物）和miR-27a-I（miR-27a的抑制劑）處理感染Mtb的巨噬細(xì)胞，然后在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行菌落形成單位（CFU）的檢測(cè)，從而判斷Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活情況。結(jié)果顯示miR-27a-M能顯著促進(jìn)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活，相反miR-27a-I能顯著抑制Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活。
前人研究表明，Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活受自噬控制，而LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化與自噬體的形成有關(guān)，并且這種轉(zhuǎn)化是自噬的關(guān)鍵標(biāo)志物。miR-27a的過(guò)表達(dá)顯著降低了LC3-II的量，而miR-27a的抑制劑增加了LC3-II的量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-27a通過(guò)自噬對(duì)Mtb發(fā)揮作用，作者使用mRFPGFP染料，監(jiān)測(cè)LC3標(biāo)志物在細(xì)胞內(nèi)自噬情況：黃色非自噬，紅色自噬。在感染Mtb的巨噬細(xì)胞中，miR-27a-M顯著抑制自噬體的形成，而miR-27a-I加速自噬體成熟。當(dāng)巨噬細(xì)胞中miR-27a的基因缺失時(shí)，LC3-II和自噬體的量升高。以上證據(jù)都表明miR-27a通過(guò)抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生從而促進(jìn)胞內(nèi)Mtb的存活。

圖2. miR-27a通過(guò)抑制自噬促進(jìn)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活

3.miR-27a增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)Mtb的易感性
為了評(píng)估m(xù)iR-27a在體內(nèi)TB發(fā)病機(jī)制中的功能作用，作者分別用Mtb的 H37Rv菌株去感染W(wǎng)T小鼠或miR-27a 缺失的小鼠，28天后檢測(cè)組織病理學(xué)損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在WT小鼠的肺組織中Mtb感染強(qiáng)烈，但是miR-27a缺失的小鼠的肺中的Mtb感染較少。
通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)宿主的先天防御是研發(fā)針對(duì)TB的新型治療最有前景的方式。為了研究miR-27a的抑制是否可以轉(zhuǎn)化為宿主定向療法（HDT），作者使用miR-27a antagomir（miR-27a抑制劑）在小鼠Mtb感染模型中抑制miR-27a并測(cè)試其治療功效，結(jié)果證明了該抑制劑對(duì)小鼠模型中Mtb感染有治療效果。

    

圖3. miR-27a增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)Mtb的易感性
miR-27a抑制劑對(duì)Mtb感染有治療效果

4.miR-27a直接靶向于Cacna2d3
miR-27a通過(guò)什么方式抑制細(xì)胞自噬從而促進(jìn)胞內(nèi)Mtb的存活的呢？作者使用堿基互補(bǔ)配對(duì)的方法，發(fā)現(xiàn)一系列miR-27a的潛在靶標(biāo)，作者選擇Cacna2d3（Cac3）進(jìn)行下一步研究。Cacna2d3的3'-UTR中具有miR-27a的特異性結(jié)合位點(diǎn)，為了確認(rèn)Cacna2d3是否是miR-27a的直接靶標(biāo)，我們進(jìn)行了Cacna2d3的野生型（WT）和突變型（mut）的熒光素酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-27a可以直接與Cacna2d3的3'-UTR結(jié)合從而抑制Cacna2d3的表達(dá)。同樣的，在感染Mtb的小鼠巨噬細(xì)胞和來(lái)自TB患者的PBMC中，Cacna2d3的mRNA水平也很低。隨后作者分別檢測(cè)miR-27a-M和miR-27a-I處理后的Cacna2d3表達(dá)量，同樣發(fā)現(xiàn)兩者之間存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系。且在沉默miR-27a后，Cacna2d3表達(dá)量隨時(shí)間增加。以上證據(jù)都表明，miR-27a可以直接與Cacna2d3結(jié)合從而抑制Cacna2d3的表達(dá)。

圖4. miR-27a直接與Cacna2d3結(jié)合抑制Cacna2d3的表達(dá)

5.Cacna2d3通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬降低Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活
為了研究Cacna2d3在Mtb感染中的作用，作者進(jìn)行了CFU分析，以了解其對(duì)巨噬細(xì)胞中Mtb在細(xì)胞內(nèi)存活的影響。首先，作者在體外用siRNA沉默Cacna2d3，發(fā)現(xiàn)Mtb活力顯著增加。接著作者又進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，引入了Cacna2d3突變小鼠，同樣發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中Mtb在細(xì)胞內(nèi)存活增加。透射電子顯微鏡（TEM）分析顯示，與WT細(xì)胞相比，在缺失Cacna2d3的巨噬細(xì)胞中積累了相對(duì)更多的細(xì)菌。當(dāng)用Mtb感染時(shí)，缺失Cacna2d3的巨噬細(xì)胞中LC3-II的量同樣減少。共聚焦顯微鏡分析顯示，通過(guò)siRNA或PB抑制對(duì)Cacna2d3的抑制顯著降低了細(xì)胞自噬。這些結(jié)果表明Cacna2d3可能通過(guò)促進(jìn)自噬從而降低Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活率。

圖5. Cacna2d3通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬降低Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活

6.miR-27a通過(guò)Cacna2d3和Ca2 +調(diào)節(jié)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活率
為了確定miR-27a是否通過(guò)靶向Cacna2d3來(lái)調(diào)節(jié)Mtb在細(xì)胞內(nèi)存活，作者分別用miR-27a-M和miR-27a-I轉(zhuǎn)染W(wǎng)T和Cacna2d3缺失的巨噬細(xì)胞，然后用Mtb感染24小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-27a-M轉(zhuǎn)染后顯著增加了WT巨噬細(xì)胞中Mtb的細(xì)菌存活率，但對(duì)Cacna2d3缺失的巨噬細(xì)胞中Mtb細(xì)菌存活率無(wú)影響。同樣的，miR-27a-I?顯著降低WT巨噬細(xì)胞中Mtb的細(xì)菌存活率，但不顯著降低Cacna2d3缺失的巨噬細(xì)胞中Mtb細(xì)菌存活率。共聚焦顯微鏡分析顯示，miR-27a-M抑制WT巨噬細(xì)胞中LC3斑點(diǎn)（自噬體特征）的形成，而miR-27a-I促進(jìn)了WT巨噬細(xì)胞中LC3斑點(diǎn)的形成。同樣，它們對(duì)Cacna2d3缺失的巨噬細(xì)胞中LC3斑點(diǎn)形成的無(wú)顯著影響。這些結(jié)果表明miR-27a可能通過(guò)靶向Cacna2d3來(lái)抑制自噬從而促進(jìn)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活率。此外，作者針對(duì)miR-27a的另外兩個(gè)候選靶標(biāo)Plk2和St6galnac3也做了相應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)它們也能增加miR-27a缺失后巨噬細(xì)胞中Mtb的細(xì)胞內(nèi)存活率，所有這些結(jié)果表明miR-27a可以同時(shí)靶向多個(gè)轉(zhuǎn)錄物，對(duì)Mtb生存力有效累積效應(yīng)。

圖6. miR-27a通過(guò)Cacna2d3調(diào)節(jié)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活率

接下來(lái)作者又檢查了miR-27a是否通過(guò)Ca2 +信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活率。轉(zhuǎn)染?miR-27a-M顯著抑制Mtb誘導(dǎo)的Ca 2+流入，而轉(zhuǎn)染miR-27a-I?顯著增強(qiáng)Ca 2+流入。類(lèi)似地，在對(duì)Mtb感染的反應(yīng)中，與WT巨噬細(xì)胞相比，miR-27a缺失的巨噬細(xì)胞能顯著增強(qiáng)Ca 2+流入。與WT巨噬細(xì)胞相比，用Ca2 +抑制劑BPD預(yù)處理miR-27a缺失的巨噬細(xì)胞，Mtb存活率沒(méi)有降低。在用BPD預(yù)處理的miR-27a缺失的巨噬細(xì)胞中也未發(fā)現(xiàn)LC3斑點(diǎn)的形成有顯著增。這些結(jié)果表明，miR-27a可能通過(guò)下調(diào)Ca2 +信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)Mtb的存活。

為了研究miR-27a與Cacna2d3在體內(nèi)的相關(guān)性，分別用Mtb感染W(wǎng)T和Cacna2d3缺失的小鼠14天，然后每3天用一次NC抗腫瘤藥和miR-27a抑制劑治療14天。然后對(duì)感染小鼠的肺進(jìn)行H&E染色。發(fā)現(xiàn)miR-27A抗腫瘤藥治療可減輕病理?yè)p害，抗酸染色和CFU分析顯示，Mtb感染的WT小鼠肺內(nèi)細(xì)菌滴度明顯降低，而Mtb感染Cacna2d3缺失的小鼠則無(wú)明顯變化，提示miR-27a可能通過(guò)體內(nèi)靶向Cacna2d3調(diào)節(jié)Mtb的存活。

圖7. miR-27a通過(guò)Ca2 +信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)Mtb在細(xì)胞內(nèi)的存活率

為探索結(jié)核菌感染發(fā)病新機(jī)制，戈寶學(xué)教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)Mtb感染的巨噬細(xì)胞、小鼠以及結(jié)核病人的樣本進(jìn)行miRNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌感染會(huì)顯著上調(diào) miR-27a的表達(dá)。miR-27a能顯著抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生從而促進(jìn)胞內(nèi)結(jié)核菌的存活并加重結(jié)核菌感染發(fā)病。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的離子通道Cacna2d3 并抑制了Cacna2d3基因的表達(dá)，從而損壞了宿主細(xì)胞鈣信號(hào)通路和細(xì)胞自噬途徑以促進(jìn)了結(jié)核菌的存活和感染發(fā)病。最后，miR-27a的抑制劑的使用能夠有效地減輕結(jié)核分枝桿菌感染引起的肺部病理?yè)p傷，以及降低肺部荷菌量。該研究不僅揭示了結(jié)核菌通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的miRNA 來(lái)抑制鈣信號(hào)介導(dǎo)的自噬的免疫逃避新途徑從而為結(jié)核病的診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)，同時(shí)，miR-27a的抑制劑作為一種新型的抗結(jié)核藥物已經(jīng)在開(kāi)發(fā)研究中。
 
通訊作者簡(jiǎn)介
本文通訊作者是同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市肺科醫(yī)院戈寶學(xué)教授。戈寶學(xué)教授于1999年獲美國(guó)加州大學(xué)遺傳學(xué)博士學(xué)位。1999－2002年期間，在美國(guó)SCRIPPS研究所作博士后，2002年獲中科院百人計(jì)劃引進(jìn)到中科院上海生科院任課題組長(zhǎng)，2011年起任同濟(jì)大學(xué)特聘教授，博導(dǎo)，醫(yī)學(xué)院院長(zhǎng)助理，上海市結(jié)核�。ǚ危┲攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心主任，973項(xiàng)目首席科學(xué)家。先后獲得國(guó)家基金委杰出青年基金，第一屆談家楨生命科學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)，教育部長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授。
戈教授主要研究感染免疫中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制，在Science、 Nature Immunology,、Cell Host & Microbe、 PLOS Pathogens,、JI,、JBC,、Cellular Signaling 等國(guó)際著名雜志上發(fā)表研究論文四十多篇。目前擔(dān)任法國(guó)MICROBES & INFECTION 雜志編委。上海市肺科醫(yī)院研究實(shí)習(xí)員劉峰博士，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心助理研究員陳建霞以及結(jié)核科主治醫(yī)師王鵬為該論文的共同第一作者。在戈寶學(xué)教授的帶領(lǐng)下，該實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事圍繞肺結(jié)核預(yù)防和診治開(kāi)展基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。

全文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-018-06836-4

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