m6A RNA甲基化是當(dāng)前在LncRNA，環(huán)狀RNA等非編碼RNA之后最為火熱的科研明星，到底有多火？擺出數(shù)據(jù)告訴你！

2019年才過去一半還不到，已發(fā)表文章數(shù)就已占去年的7成。RNA甲基化領(lǐng)域，不僅文章數(shù)量多，高分文章也有許多。據(jù)統(tǒng)計，僅2019年上半年就發(fā)表了多篇Nature，Cell，Cell Stem Cell，Nature Immunolgy這類的頂級期刊，10分以上m6A文章就有18篇之多。

m6A RNA甲基化作為2018年國自然熱點，申請的課題主要圍繞writer，eraser和reader。
做膩了writer，eraser？那讓我們來看看reader，YTHDF家族由于在核外參與蛋白翻譯和降解，是reader里最明星的研究對象，可m6A reader酶千千萬萬，您研究的基因除了YTHDF家族外，可能還與其他reader結(jié)合。

今天，讓我們開開腦洞，談一談另一個reader hnRNPA2B1，看看像這類核內(nèi)核外都有表達(dá)的reader是怎么來做研究的。

結(jié)直腸癌Colorectal cancer（CRC）是一類腸道發(fā)生癌變的疾病。目前，關(guān)于CRC發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制還未有詳細(xì)報道。已有研究指出，LncRNA分子在腫瘤發(fā)生，發(fā)展，甚至是遷移的過程中發(fā)揮重要機(jī)制。因此，本文以LncRNA為切入點，首先通過LncRNA測序找到一個目標(biāo)LncRNA---RP11，在CRC中高表達(dá)的趨勢，且表型與細(xì)胞遷移正相關(guān)。接著，通過RNA Pull Down-質(zhì)譜技術(shù)，證實該LncRNA與下游蛋白hnRNPA2B1是直接結(jié)合關(guān)系，該蛋白可是m6A RNA修飾的明星閱讀酶（Reader）呀！那這個LncRNA勢必也參與了m6A RNA 甲基化的過程。接下來，讓我們跟隨作者思路，看看LncRNA結(jié)合m6A的機(jī)制類文章是怎么做的。

 

發(fā)表期刊：Molecular Cancer
影響因子：7.8
實驗方法：LncRNA 測序，MeRIP-qPCR，RNA Pull Down，RIP，LncRNA定量PCR，mRNA定量PCR
實驗材料：CRC臨床樣本等，結(jié)直腸癌細(xì)胞系等

1. LncRNA RP11在CRC細(xì)胞和組織中高表達(dá)
CRC組織（癌癥1期和癌癥3期）與癌旁組織分別進(jìn)行LncRNA測序（云序可提供此服務(wù)），篩選到在癌癥1期和3期都差異高表達(dá)的LncRNA---RP11。在測序樣本和32個臨床樣本組織中，通過LncRNA 定量PCR證實其在實驗組中高表達(dá)。已有結(jié)腸癌和直腸癌數(shù)據(jù)庫結(jié)果也證實這類表達(dá)趨勢。RP11在多個結(jié)直腸癌細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，并在CRC患者轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織原代培養(yǎng)的SW620細(xì)胞中高表達(dá)。

    

圖1. RP11在CRC組織和細(xì)胞中高表達(dá)

2.RP11在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)CRC細(xì)胞散布
為進(jìn)一步闡明RP11在體內(nèi)和體外的功能機(jī)制。作者首先證實RP11過表達(dá)細(xì)胞系能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力。由于此過程影響了E-Cad，F(xiàn)N和Vim等標(biāo)志物蛋白的表達(dá)量，因此可能與EMT和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)。接著，作者在異種移植腫瘤的裸鼠體內(nèi)高表達(dá)RP11基因，發(fā)現(xiàn)該基因能夠促進(jìn)腫瘤的增殖。作者在裸鼠體內(nèi)通過尾部注射方式，導(dǎo)入穩(wěn)定高表達(dá)RP11的癌癥細(xì)胞，飼養(yǎng)8周后，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至小鼠肝臟組織中。

   

圖2. 體外：RP11促進(jìn)癌細(xì)胞遷移
體內(nèi)：RP11促進(jìn)癌組織增殖和遷移

3.轉(zhuǎn)錄因子Zeb1介導(dǎo)RP11調(diào)控CRC細(xì)胞散布
已有研究表明，LncRNA能夠通過順勢調(diào)控機(jī)制影響其周圍的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。因此，本研究在LncRNA RP11周圍找到了6個轉(zhuǎn)錄本，分別為NUDT12, C5orf30, PPIP5K2, GIN1, RP11-6 N13.1和CTD-2374C24。通過mRNA定量PCR證實以上轉(zhuǎn)錄本不管是在RP11高表達(dá)組以及RP11表達(dá)量最高的SW620細(xì)胞系中，都未差異表達(dá)。所以，RP11的功能機(jī)制不是通過順勢調(diào)控的模式影響的。

既然不是順勢調(diào)控引起的，那還會是什么呢？

是否是下游結(jié)合蛋白呢？
為了證實以上猜想，作者在過表達(dá)細(xì)胞中通過mRNA定量PCR技術(shù)，檢測了多個與EMT相關(guān)因子的表達(dá)量，檢測結(jié)果顯示Zeb1與RP11的表達(dá)模式正相關(guān)。并且在Zeb1過表達(dá)細(xì)胞系中，證實能夠影響FN和Vim標(biāo)志物的表達(dá)量。因此，RP11的下游可能是Zeb1。
為了驗證前面的猜想，作者通過Zeb1 RIP-LncRNA PCR（云序可提供此服務(wù)）和RP11 Pull Down-質(zhì)譜技術(shù)（云序可提供此服務(wù)），證實Zeb1與RP11在mRNA和蛋白層面都不是直接結(jié)合的關(guān)系。

        

圖3. Zeb1可能是RP11間接的下游

4.RP11-hnRNPA2B1-mRNA復(fù)合體參與RP11調(diào)控Siah1和Fbxo45
同樣的，作者推測下游蛋白可能是Siah1和Fbxo45。在mRNA層面，通過RP11 RIP-mRNA PCR，證實兩者調(diào)控了RP11和Zeb1的表達(dá)。在蛋白層面，通過RP11 Pull Down-質(zhì)譜技術(shù)證實三者并非直接結(jié)合。

為證實RP11是如何調(diào)控下游mRNA Siah1和Fbxo45，作者在前期RP11 Pull down-質(zhì)譜結(jié)果中，找到與RP11直接結(jié)合的hnRNPA2B1蛋白。hnRNPA2B1 RIP-mRNA PCR實驗證實RP11，Siah1和Fbxo45在mRNA層面是直接結(jié)合的關(guān)系。已有研究表明hnRNP2B1是一種RNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布。通過結(jié)構(gòu)分析LncRNA結(jié)構(gòu)，證實其能夠與Siah1的CDS區(qū)和Fbxo45的3’UTR區(qū)結(jié)合。總的來說，RP11通過形成RP11-hnRNPA2B1-mRNA復(fù)合體調(diào)控下游mRNA Siah1和Fbxo45的表達(dá)。

         

圖4. RP11形成RP11-hnRNPA2B1-Siah1-Fbxo45復(fù)合體參與細(xì)胞遷移

5. m6A修飾參與CRC細(xì)胞中RP11表達(dá)上調(diào)機(jī)制
首先，作者懷疑RP11的高表達(dá)與DNA甲基化相關(guān)，通過DNA甲基化抑制酶處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)RP11表達(dá)量不變，證實在CRC細(xì)胞中RP11表達(dá)量與DNA甲基化無關(guān)。同時，實驗也證實其與組蛋白乙酰化無關(guān)。

已有研究表明m6A修飾調(diào)控LncRNA的表達(dá)及功能過程。作者通過MeRIP-qPCR技術(shù)（云序可提供此服務(wù)），在三種細(xì)胞系中都證實了RP11上發(fā)生了m6A RNA甲基化修飾。并且分別過表達(dá)甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3和去甲基化轉(zhuǎn)移酶ALKBH5都能夠影響RP11的表達(dá)。接下來，作者旨在CRC細(xì)胞中深入研究m6A 修飾是如何調(diào)控RP11表達(dá)的？首先，筆者借助Act-D物質(zhì)抑制轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)現(xiàn)在Mettl3過表達(dá)組中RP11的表達(dá)量沒有受到影響，原因可能是Mettl3促進(jìn)RP11在染色質(zhì)中積累，從而對RP11的表達(dá)起到了穩(wěn)定作用。m6A reader蛋白hnRNPA2B1參與了此過程。

圖5. RP11存在m6A修飾并受Mettl3和AlKBH5調(diào)控

6. m6A/RP11/Zeb1間的關(guān)系和CRC細(xì)胞體內(nèi)的進(jìn)展
通對分析大量不同分期臨床樣本表達(dá)情況表明m6A修飾先調(diào)控RP11，RP11在影響Siah1-Fbxo45/Zeb1。借助KM曲線，作者發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RP11直腸癌患者的生存情況并不樂觀。同時，也分析了下游基因與病人其他臨床指標(biāo)間的關(guān)系。總體而言，證實了m6A/RP11/Zeb1促進(jìn)了CRC的發(fā)生發(fā)展過程。

總結(jié)
在本研究中，作者首先通過LncRNA高通量測序手段，在CRC疾病組中篩到高表達(dá)的LncRNA----RP11，并證實其能夠促進(jìn)腫瘤遷移。
隨后，作者旨在研究RP11下游結(jié)合蛋白是什么，是如何調(diào)控促進(jìn)遷移表型的。
一方面：借助LncRNA Pull Down，快速鎖定與RP11結(jié)合的蛋白就是m6A reader hnRNPA2B。通過RIP-PCR，快速找到與該蛋白結(jié)合的RNA是RP11。另一方面，借助MeRIP-qPCR，證實在3種疾病相關(guān)細(xì)胞系中RP11上都存在著m6A 修飾的情況。同時，Mettl3作為其上游促進(jìn)RP11穩(wěn)定性，從而促進(jìn)CRC的發(fā)生發(fā)展。

云序生物國內(nèi)獨家提供RNA甲基化測序一站式服務(wù)
云序生物提供比色法檢測整體m6A甲基化修飾水平、RNA甲基化測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA Pull Down機(jī)制研究服務(wù)。RNA甲基化測序技術(shù)是真正實現(xiàn)m6A，m5C和m1A修飾，檢測分子除mRNA外，還能檢測環(huán)狀RNA，LncRNA及其他非編碼RNA。2016年至今，樣本數(shù)量累積超過5000+，MeRIP富集成功率高達(dá)98%以上。
現(xiàn)在，為解決客戶樣本量少的問題，特推出超微量MeRIP測序技術(shù)，500ng總RNA既可進(jìn)行測序?qū)嶒�。特殊樣本也可進(jìn)行RNA甲基化測序，如血清，血漿，外泌體和石蠟樣本。

全文鏈接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-019-1014-2

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