單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是這兩年來非常流行的高通量組學(xué)研究工具，然而，是不是所有的研究都適合用該方法？是不是所有的問題都可以通過該方法來解釋？這是一個值得探討的問題。從現(xiàn)有的研究報道來說，單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究很好地解決了細胞圖譜，發(fā)育過程等重要的生物學(xué)問題。但是在相對比較傳統(tǒng)的研究方向，是否也能利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序方法來使研究更加深入和出色？

本期小編通過對近期發(fā)表在《Cell Stem Cell》上的文獻的重點內(nèi)容解析，來領(lǐng)略下生發(fā)機制研究中，單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巧妙運用，如何為解釋內(nèi)在的生發(fā)關(guān)鍵時期的調(diào)控通路提供了直接證據(jù)。

研究背景

哺乳動物毛發(fā)生命周期是由毛囊（HF）經(jīng)歷了由生長期（anagen）,退化期（catagen）和休止期（telogen）為代表的三個重要精細調(diào)控階段。來自毛囊干細胞（HFSCs）的角質(zhì)細胞接受到如Wnt或者Shh等通路的激活信號后，會在生長期促進細胞增殖；在休止期接受到如BMPs等抑制信號時，會促進細胞靜止過程。

JAK-STAT通路調(diào)控休止期靜止的潛在上游調(diào)控信號被認為是一些細胞因子家族的因子。制瘤素（OSM）顯示出抑制plucking誘導(dǎo)的生長期，而IL-6可以誘導(dǎo)毛囊從生長期進去退化期。OSM和IL-6屬于gp130-dependent家族的一類細胞因子，可誘導(dǎo)LIF，CT-1，CNTF的產(chǎn)生。在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)OSM抑制JAK-STAT通路誘導(dǎo)的毛發(fā)生長過程，可能是作為一種內(nèi)源的抑素維持休止期。通過進一步的單細胞測序和驗證，發(fā)現(xiàn)OSM是由一類TREM2+的巨噬細胞在休止期早期產(chǎn)生來影響毛發(fā)生長周期的過程。

圖1 研究主要結(jié)果展示

研究主體

為研究OSM在毛發(fā)生長過程中的調(diào)控作用，本研究先進行了一系列的傳統(tǒng)分子生物學(xué)實驗，得到以下幾個結(jié)論：

1. OSM通過OMSR-JAK-STAT信號通路維持毛囊處于休止期；
2. OSMRβ和其共受體gp130在早期和中期休止期時，在HFSCs細胞凸起與胚芽中，共定位激  活pSTAT5；
3. OSMRb信號通路的干擾縮短了第二個休止期周期；
4. 在休止期中期干擾OMSRβ和STAT5表達促進HFSC的增值和生長期起始；
5. 真皮細胞中的OSM來源于休止期組織中的巨噬細胞；
6. 巨噬細胞產(chǎn)生的OSM在體外能抑制HFSC的增殖；

通過以上的實驗，該研究已經(jīng)打通了OSM影響生發(fā)過程中的重要調(diào)控過程以及OSM的主要來源問題，應(yīng)該來說是傳統(tǒng)生物分子機制實驗的標(biāo)準操作。但是，該研究沒有將結(jié)論停留于此，運用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序手段，該研究繼續(xù)往前走了一大步。

那么運用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，研究人員到底做了些什么，發(fā)現(xiàn)了什么呢？

7. 真皮中CD4+免疫細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究人員對休止期早（P45）中（P50，P63）晚（P80）三個時期的真皮CD45+免疫細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（10XGenomics平臺）。分析顯示，P45時期的細胞共分成13個不同的Cluster。利用已有的巨噬細胞markers CD68，F(xiàn)4/80（Adgre1）和Csf1r，P45期巨噬細胞重新細分到其中的5個不同的cluster中：0，1，2，5，11。而OSM主要是在Cluster11中表達豐度較高。

8. 產(chǎn)生OSM的巨噬細胞是TREM2+且有著獨特的基因表達譜

通過對每個cluster中的顯著上調(diào)基因進行聚類，可以發(fā)現(xiàn)Cluster 6 細胞和“M2-like”的Cluster3表達模式很相似。有意思的是，這兩類細胞可以用TREM2 marker區(qū)分來開，TREM2特異性地在生產(chǎn)OSM的Cluster 6中表達。

利用在線資源Enrichr對cluster 6的基因分析發(fā)現(xiàn)，其功能主要與小神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)，是中樞神經(jīng)的長期組織駐留巨噬細胞。小神經(jīng)膠質(zhì)細胞相關(guān)的marker（Apoe,Aif-1,Cx3cr1和Tmem119）都在該類細胞中由表達。因此，OSM和TREM2是culster 6中特異性高表達的基因。

圖3 產(chǎn)生OSM的巨噬細胞的表達特征譜

9. TREM2+巨噬細胞與HFSCs關(guān)系密切

研究人員對小鼠真皮組織選取30 μm組織塊進行markers免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)Aif-1和CD11b與OSM在P45期的毛囊免疫細胞中共定位；TREM2和F4/80與OSM在靠近休止期HFSCs的巨噬細胞中共定位。這部分的結(jié)果表明，OSM由處于休止期HFs中的TREM2+巨噬細胞產(chǎn)生。

10. 休止期后TREM2+巨噬細胞會減少

如果TREM2+巨噬細胞抑制HFSC的增值，那么在下一輪的生長期之前應(yīng)該會減少。為驗證這樣的假設(shè)，研究人員對休止期的三個不同時間點的單細胞數(shù)據(jù)進一步分析。結(jié)果顯示，隨著休止期過程的發(fā)展，CD45+免疫細胞的多樣性逐漸減少，從P45的13類減少到P63的3類。且產(chǎn)生OSM的細胞類群由P45到P50時，也變少了，在P63和P80更加減少。這樣的結(jié)果通過流式細胞計數(shù)也得到了驗證。對OSM和小膠質(zhì)細胞markers的軌跡分析也顯示，休止期它們的表達持續(xù)減少。因此，休止期，TREM2+巨噬細胞通過產(chǎn)生OSM，影響OSMRβ-STAT5信號通路，維持HFSC細胞的靜止?fàn)顟B(tài)。

通過以上分析，該研究不光找到了OSM怎么影響休止期過程，也發(fā)現(xiàn)了OSM真正的產(chǎn)生來源是一類TREM2+巨噬細胞。后期，在休止期通過遺傳學(xué)手段，抗體中和和小分子抑制劑抑制巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)可以有效誘導(dǎo)生長期過程。

以上是該研究的主要內(nèi)容及單細胞研究過程中的重點解析�？梢钥吹�，該研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組實驗，一方面解釋了OSM到底是由哪一類特定的巨噬細胞產(chǎn)生而來；同時也發(fā)現(xiàn)了OSM在休止期三個不同階段的變化過程，可以說巧妙地將單細胞技術(shù)非常完美地利用了起來。因此，單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)，只要能進行合理的設(shè)計和規(guī)劃，相信廣大的研究中都可以利用起來。

參考文獻：Wang, E.C.E., et al., A Subset of TREM2(+) Dermal Macrophages Secretes Oncostatin M to Maintain Hair Follicle Stem Cell Quiescence and Inhibit Hair Growth. Cell Stem Cell, 2019. 24(4): p. 654-669 e6.

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