精子生成過程是一個(gè)復(fù)雜又具有嚴(yán)格分化過程的生理過程，繼18年10月份《Cell Research》上的成年人睪丸轉(zhuǎn)錄組圖譜研究[1]和19年2月份《Cell Reports》上新生與成年人睪丸細(xì)胞單細(xì)胞水平鑒定分類[2]的步伐，本月在《Nature Communications》上，歐洲生物信息學(xué)研究所歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究人員用10x Genomics平臺(tái)對(duì)成年和幼年發(fā)育期間小鼠的睪丸進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析[3]。該研究精確分類了生殖細(xì)胞發(fā)育不同階段的細(xì)胞，包括稀有體細(xì)胞和精原細(xì)胞。值得一提的是，為精確捕獲低轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞類型，研究人員應(yīng)用一種新的統(tǒng)計(jì)工具EmptyDrops，識(shí)別到了先前研究沒有發(fā)現(xiàn)的細(xì)線期和偶線期精母細(xì)胞。此外，通過CUR和RUN實(shí)驗(yàn)，研究人員對(duì)減數(shù)分裂后X染色體重新激活的時(shí)間動(dòng)態(tài)模式進(jìn)行了分析，確定了減數(shù)分裂后經(jīng)歷了大量的染色質(zhì)重塑現(xiàn)象。該研究為理解精子生成過程中的復(fù)雜過程及重要事件提供了新的認(rèn)識(shí)。

圖1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)線路

適應(yīng)性免疫是建立在從克隆多樣的幼稚前體庫中選擇和擴(kuò)展抗原特異性T細(xì)胞基礎(chǔ)上，但我們對(duì)于早期適應(yīng)性免疫的認(rèn)識(shí)還很有限。本月在《Nature Immunology》上，來自萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心免疫血液學(xué)與輸血學(xué)系的研究人員，通過流式細(xì)胞分選，10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和免疫組庫分析，鑒定到了胎兒腸道22種CD4+T細(xì)胞類型[4]。結(jié)果顯示，Memory-like CD4+T細(xì)胞高表達(dá)Ki-67。通路分析揭示了與細(xì)胞活化和促炎效應(yīng)功能相關(guān)的分化軌跡。TCR譜系分析表明克隆擴(kuò)增，不同的譜系特征和Memory-like CD4 + T細(xì)胞亞群之間的相互連接。流式細(xì)胞成像表明Memory-like CD4 + T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞共定位。該研究提供了人胎兒腸道中產(chǎn)生Memory-like CD4 + T細(xì)胞的證據(jù)。

圖2 胎兒腸道CD4 + T細(xì)胞的分化軌跡分析
 

（2）exhausted CD8+ T 細(xì)胞亞群差異介導(dǎo)腫瘤控制和免疫檢查點(diǎn)阻斷響應(yīng)

T細(xì)胞功能障礙是許多癌癥的標(biāo)志，但是T細(xì)胞功能障礙的基礎(chǔ)和抑制性受體PD-1（抗PD-1）的抗體阻斷再生T細(xì)胞的機(jī)制尚不完全清楚。本月在《Nature Immunology》上，來自Dana-Farber癌癥研究所兒科腫瘤科的研究人員通過10X Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗PD-1療法作用于exhausted CD8+ T腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的特定亞群[5]。與慢性病毒感染類似，功能失調(diào)的CD8 + TIL具有經(jīng)典的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄耗竭特征。包括“祖細(xì)胞耗盡”TILs在內(nèi)的exhausted CD8+ T 細(xì)胞亞群，能保留多功能性，持續(xù)長期存在并分化為“最終耗竭”TILs�；加休^高百分比的祖源耗盡細(xì)胞的黑色素瘤患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較長。因此，擴(kuò)大祖源耗盡的CD8 + T細(xì)胞群可能是改善對(duì)檢查點(diǎn)阻斷響應(yīng)的重要方法。

（3）干細(xì)胞記憶樣T細(xì)胞的產(chǎn)生過程追蹤

Naive T細(xì)胞選擇性分化成多能T細(xì)胞在臨床上對(duì)于基于細(xì)胞的癌癥免疫療法具有重要意義。在本月《Nature Biotechnology》上，來自斯坦福大學(xué)的研究人員，采用改良的染料稀釋法對(duì)Naive T細(xì)胞進(jìn)行了增殖過程跟蹤[6]。利用23個(gè)marker，研究人員定義了主要由分裂狀態(tài)或者時(shí)間控制的一組蛋白，并發(fā)現(xiàn)未分裂的細(xì)胞占表型多樣性細(xì)胞的大部分。研究人員構(gòu)建了Naive T細(xì)胞擴(kuò)增過程中的細(xì)胞狀態(tài)變化圖譜。通過檢查該譜圖上的細(xì)胞信號(hào)，研究人員選擇了一種BTK和ITK抑制劑——ibrutinib，在T細(xì)胞分化之前給予處理以指導(dǎo)細(xì)胞分化成T單細(xì)胞記憶（TSCM）樣表型細(xì)胞。本研究的細(xì)胞命運(yùn)追蹤方法為指導(dǎo)細(xì)胞分化提供了一種可行工具。

圖3 T細(xì)胞增殖跟蹤法用于癌癥免疫治療路線
 

3.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序用于腦神經(jīng)研究
下丘腦外側(cè)區(qū)域（LHA）協(xié)調(diào)一系列基本行為，包括睡眠，清醒，喂養(yǎng)，壓力和動(dòng)機(jī)行為。在本月《Nature Neuroscience》上，來自康涅狄格大學(xué)生理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)系的研究人員通過10X Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法對(duì)小鼠LHA中分子不同細(xì)胞類型進(jìn)行了分析和鑒定[7]。該研究共定義了15個(gè)不同谷氨酸能神經(jīng)元群和15個(gè)GABAergic神經(jīng)元，包括已知的和新的細(xì)胞類型。運(yùn)用解剖學(xué)和行為學(xué)方法，研究人員進(jìn)一步鑒定了一種生長抑素表達(dá)的新神經(jīng)元群體，在先天運(yùn)動(dòng)行為中特異性表達(dá)。本研究為更好地理解LHA功能奠定了基礎(chǔ)。

圖4 LHA^Glut和LHA^GABA神經(jīng)元細(xì)胞tSNE分類圖

4.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在植物領(lǐng)域嶄露頭角
相比動(dòng)物的單細(xì)胞研究，由于植物具有細(xì)胞壁的特點(diǎn)，使得植物的單細(xì)胞研究相比較難，但是繼2月份的擬南芥根組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[8]，本月在《Developmental Cell》上又發(fā)表了一篇基于擬南芥根組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究報(bào)道[9]。來自德國圖賓根大學(xué)植物分子生物學(xué)中心的研究人員運(yùn)用10X Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法對(duì)擬南芥的根組織細(xì)胞進(jìn)行了圖譜鑒定。該圖譜提供了詳細(xì)的時(shí)空信息，確定了所有的主要細(xì)胞類型，包括靜止中心（QC細(xì)胞）的稀有細(xì)胞，揭示了在細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的細(xì)胞形狀和功能過程中的關(guān)鍵發(fā)育調(diào)控因子和下游基因。通過擬時(shí)間序列分析，該研究描繪了從細(xì)胞從niche到分化的精細(xì)發(fā)生軌跡及主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。幾乎在同一時(shí)間，華盛頓大學(xué)基因組科學(xué)中心的研究人員同樣利用擬南芥根組織的單細(xì)胞測序研究在植物頂級(jí)期刊《Plant Cell》上發(fā)表了擬南芥根圖譜結(jié)果[10]。在該研究中，除了和上述兩篇文章類似的根部細(xì)胞分類之外，還通過熱脅迫處理，來揭示在非生物脅迫下細(xì)胞內(nèi)部的響應(yīng)異質(zhì)性。該研究表面單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在植物發(fā)育和生理學(xué)研究中都有這廣闊的前景。

圖5 根細(xì)胞中分生到細(xì)胞成熟過程的基因變化熱圖
 

5.單細(xì)胞研究方法學(xué)進(jìn)展
除了以上單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展之外，基于單細(xì)胞組學(xué)分析的方法學(xué)研究在本月也有成果發(fā)表，其中包括《Nature Method》關(guān)于細(xì)胞成分分析的CPM方法[11]，《Nucleic Acids Research》關(guān)于基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的細(xì)胞特異性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[12]，《Genome Biology》上關(guān)于基于液滴單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中低轉(zhuǎn)錄水平細(xì)胞識(shí)別（EmptyDrops）軟件的開發(fā)[13]，《Nature Biotechnology》上用于細(xì)胞可能性命運(yùn)鑒定的Palantir算法開發(fā)[14]及《Nature Method》上有關(guān)tSNE算法優(yōu)化的研究[15]。這些研究都為未來單細(xì)胞組學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。

為方便國內(nèi)科研工作者的單細(xì)胞組學(xué)研究，上海生物芯片有限公司（SBC）于2018年引進(jìn)10x Genomics單細(xì)胞組學(xué)檢測平臺(tái)，可為廣大科研工作者提供從樣本到分析的一體化解決方案，歡迎廣大科研朋友們與我們開展深入的溝通和廣泛的合作

1. Guo, J., et al., The adult human testis transcriptional cell atlas. Cell Res, 2018. 28(12): p. 1141-1157.
2. Sohni, A., et al., The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level. Cell Rep, 2019. 26(6): p. 1501-1517 e4.
3. Ernst, C., et al., Staged developmental mapping and X chromosome transcriptional dynamics during mouse spermatogenesis. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 1251.
4. Li, N., et al., Memory CD4(+) T cells are generated in the human fetal intestine. Nat Immunol, 2019. 20(3): p. 301-312.
5.  Miller, B.C., et al., Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nat Immunol, 2019. 20(3): p. 326-336.
6. Good, Z., et al., Proliferation tracing with single-cell mass cytometry optimizes generation of stem cell memory-like T cells. Nat Biotechnol, 2019. 37(3): p. 259-266.
7.  Mickelsen, L.E., et al., Single-cell transcriptomic analysis of the lateral hypothalamic area reveals molecularly distinct populations of inhibitory and excitatory neurons. Nat Neurosci, 2019. 22(4): p. 642-656.
8.  Ryu, K.H., et al., Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol, 2019.
9.  Denyer, T., et al., Spatiotemporal Developmental Trajectories in the Arabidopsis Root Revealed Using High-Throughput Single-Cell RNA Sequencing. Dev Cell, 2019. 48(6): p. 840-852 e5.
10.  Jean-Baptiste, K., et al., Dynamics of gene expression in single root cells of A. thaliana. Plant Cell, 2019.
11. Frishberg, A., et al., Cell composition analysis of bulk genomics using single-cell data. Nat Methods, 2019.
12. Dai, H., et al., Cell-specific network constructed by single-cell RNA sequencing data. Nucleic Acids Res, 2019.
13.  Lun, A.T.L., et al., EmptyDrops: distinguishing cells from empty droplets in droplet-based single-cell RNA sequencing data. Genome Biol, 2019. 20(1): p. 63.
14. Setty, M., et al., Characterization of cell fate probabilities in single-cell data with Palantir. Nat Biotechnol, 2019.
15. Linderman, G.C., et al., Fast interpolation-based t-SNE for improved visualization of single-cell RNA-seq data. Nat Methods, 2019. 16(3): p. 243-245.