單細(xì)胞提取與質(zhì)譜聯(lián)用的新型無損提取檢測技術(shù)
單細(xì)胞代謝組學(xué)分析能夠?yàn)閷?xì)胞功能分析提供諸多幫助。但是受制于測試條件問題，所得到的結(jié)果一直并不理想。隨著質(zhì)譜與單細(xì)胞提取手段的發(fā)展，目前已經(jīng)出現(xiàn)了多種不同的提取方法。本文就基于FluidFM提取技術(shù)和MALDITOF聯(lián)用的新型無損提取測試技術(shù)進(jìn)行簡述。
眾所周知由于細(xì)胞異質(zhì)性的存在，使得每個(gè)細(xì)胞的實(shí)際結(jié)構(gòu)、功能都不完全相同，因此對于單細(xì)胞層面的研究變得十分具有意義。當(dāng)前單細(xì)胞測序、轉(zhuǎn)錄技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的較為完備，具有比較成熟的模型。但是單細(xì)胞代謝組學(xué)的研究卻仍處于起步階段，因?yàn)榧?xì)胞的代謝是十分復(fù)雜的。這不僅是細(xì)胞內(nèi)代謝的化學(xué)成分種類多，濃度低，并且標(biāo)記很有可能導(dǎo)致其生物功能被干擾改變。因此使用高靈敏質(zhì)譜的測量策略有可能解決這一問題。
除了檢測儀器，提取手段在檢測過程中也起到十分重要的地位。目前的提取主要手段是將細(xì)胞消化、懸浮，然后進(jìn)行裂解得到內(nèi)容。這種方法需要將細(xì)胞懸浮并使用酶進(jìn)行裂解。這一過程改變了細(xì)胞生存的環(huán)境，將無法避免的對細(xì)胞內(nèi)部代謝物產(chǎn)生破壞性的影響。此外由于單個(gè)細(xì)胞的改變也將不可避免的對周邊的細(xì)胞產(chǎn)生未知的影響。因此能夠使用原位提取，在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、活力的條件下抽取內(nèi)容的方法，將極大地幫助研究者得到最為原始的信息。然而直到目前，仍沒有理想的方法能夠在不破壞細(xì)胞情況下進(jìn)行提取。本文就通過使用FluidFM 技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞活體提取并聯(lián)用質(zhì)譜進(jìn)行代謝物的檢測進(jìn)行闡述。
由于先前已經(jīng)有CELL 報(bào)道了使用FluidFM 技術(shù)進(jìn)行活體提取的方法，本文作者通過研究這篇作者的工作，開發(fā)了一套適合MALDI-TOF 質(zhì)譜的分析方法，如圖1 所示，并證實(shí)這種方法具有很高的靈敏度。
圖1，使用FluidFM 和MALDI-TOF 聯(lián)用的單細(xì)胞質(zhì)譜分析。（A）單細(xì)胞提取示意圖；（B）將提取物放在MAMS 孔中；（C）噴灑9AA matrix 覆蓋表面；（D）MALDI-TOF 質(zhì)譜分析。
作者通過使用直接購買的400 nm 孔徑的FluidFM 探針成功從預(yù)先使用GFP-HeLa 細(xì)胞中提取出0.8~2.7 pL 的細(xì)胞質(zhì)，一方面確保細(xì)胞存活，一方面足夠用于檢測。隨后將細(xì)胞提取物放置在質(zhì)譜專用的95 μm microarrays 上，并立即吹干，以猝滅酶的活性，如圖2 所示。
圖2，HeLa細(xì)胞活體提取過程。（A）提取前；（B）提取中；（C）提取后；（D）細(xì)胞質(zhì)提儲存在探針中；（E）移動到MAMS孔上；（F）釋放提取液。
隨后將9AA 噴涂在microarrays 表面，并放入質(zhì)譜檢測。結(jié)果如圖3 所示。他們成功通過這種方法檢測到了各種酸類和磷酸類化合物，包括核糖核苷酸（cGMP）、UDP、ADP、ATP、活性糖(UDP-GlcNAc、UDP-Glc)、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、谷胱甘肽。
圖3，直接提取的HeLa 細(xì)胞質(zhì)的代謝產(chǎn)物MS 分析結(jié)果。
隨后他們使用C13 標(biāo)記的葡萄糖對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)48h 并對細(xì)胞進(jìn)行提取檢測，如圖4 所示。
圖4，U-C13 標(biāo)記的葡萄糖培養(yǎng)的HeLa 細(xì)胞的代謝產(chǎn)物結(jié)果。
一般來說質(zhì)譜檢測一般化合物的同位素峰往往以+1 為主。而U-13C 的主體骨架均已使用C13 標(biāo)記，因此同位素累積高的物質(zhì)即為代謝的主要產(chǎn)物。從結(jié)果上看同位素累計(jì)主要出現(xiàn)在核苷酸和活化糖上面，而谷氨酸和谷胱甘肽并沒有出現(xiàn)同位素累積。這說明谷氨酸和谷胱甘肽來源于培養(yǎng)基，而葡萄糖主要通過糖磷酸途徑合成活性糖和核酸。如圖5 所示。
圖5，U-13C標(biāo)記和天然的HeLa代謝產(chǎn)物的分析。箭頭表示代謝物的峰。*谷胱甘肽峰。**13C UDP GLCNAC的 [M＋13- H]-峰。
總結(jié)：
本文通過一種全新的方式，實(shí)現(xiàn)了從活細(xì)胞中直接提取細(xì)胞質(zhì)研究代謝產(chǎn)物的方法。通過這種方法能夠讓研究者在不殺死細(xì)胞，不改變細(xì)胞周邊環(huán)境的條件下研究細(xì)胞最原始的代謝信息，并給持續(xù)監(jiān)測同一個(gè)細(xì)胞提供了可能。相信在不久的將來使用FluidFM 技術(shù)提取技術(shù)將會幫助研究者更好的克服單細(xì)胞提取障礙，讓研究者得到更加可靠、精準(zhǔn)的單細(xì)胞信息。
本文通過一種全新的方式，實(shí)現(xiàn)了從活細(xì)胞中直接提取細(xì)胞質(zhì)研究代謝產(chǎn)物的方法。通過這種方法能夠讓研究者在不殺死細(xì)胞，不改變細(xì)胞周邊環(huán)境的條件下研究細(xì)胞最原始的代謝信息，并給持續(xù)監(jiān)測同一個(gè)細(xì)胞提供了可能。相信在不久的將來使用FluidFM 技術(shù)提取技術(shù)將會幫助研究者更好的克服單細(xì)胞提取障礙，讓研究者得到更加可靠、精準(zhǔn)的單細(xì)胞信息。
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)——瑞士 Cytosurge FluidFM BOT
產(chǎn)品簡介：
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)--FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。
FluidFM BOT極大的方便了單細(xì)胞水平的研究，尤其適合應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療、單細(xì)胞生物學(xué)、單細(xì)胞質(zhì)譜、單細(xì)胞基因編輯、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)--FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。
FluidFM BOT極大的方便了單細(xì)胞水平的研究，尤其適合應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療、單細(xì)胞生物學(xué)、單細(xì)胞質(zhì)譜、單細(xì)胞基因編輯、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
注射、提取、分選一體化的單細(xì)胞操縱解決方案
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