實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

CTCs在患者血液中的含量非常稀少，大約每10⁶~10⁷個(gè)白細(xì)胞中僅1個(gè)至幾個(gè)CTCs存在，靈敏度一直是其檢測(cè)及應(yīng)用的主要障礙。在眾多文獻(xiàn)報(bào)道中，人們常利用腫瘤細(xì)胞摻入試驗(yàn)評(píng)價(jià)CTCs檢測(cè)方法/系統(tǒng)的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性等指標(biāo)。

本研究選用高表達(dá)EpCAM的結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW620）作為摻入細(xì)胞（圖1），第一部分將不同數(shù)量（0～256個(gè)）SW620細(xì)胞摻入到1×10⁶個(gè)正常人PBMCs中，用ACEA Quanteon流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW620細(xì)胞的實(shí)際個(gè)數(shù)，確定儀器檢測(cè)CTCs的靈敏度。

一、SW620細(xì)胞表面EpCAM表達(dá)鑒定

圖1. SW620細(xì)胞表面EpCAM表達(dá)鑒定。將新鮮血（2mL）或摻有SW620細(xì)胞的新鮮血（1000個(gè)/2mL）用Ficoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液（GE healthcare,17-1440-02）分離PBMCs后，在以上樣本以及單獨(dú)SW620細(xì)胞中分別加入抗CD45-FITC和抗EpCAM-APC抗體孵育，設(shè)同型抗體對(duì)照，在ACEA Quanteon流式細(xì)胞儀上測(cè)試，數(shù)據(jù)采用相同設(shè)門策略分析。a. SW620細(xì)胞用IgG1 FITC和IgG2b APC同型抗體染色的結(jié)果； b-d. SW620細(xì)胞、新鮮血和摻有SW620的新鮮血用CD45-FITC和EpCAM-APC抗體染色的結(jié)果。

二、ACEA Quanteon可檢測(cè)到10⁶個(gè)正常人白細(xì)胞中的1個(gè)腫瘤細(xì)胞

圖2. 靈敏度分析。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，標(biāo)記 EpCAM-APC熒光抗體，設(shè)同型抗體對(duì)照，冰上孵育60min，用含0.5%BSA的D-PBS洗兩遍；將染色后的SW620細(xì)胞按0，2，4，8，16，32，64，128，256，512個(gè)（體積20μL）分別摻入2×10⁶個(gè)PBMCs（體積180μL）中，渦旋混勻（理論上，每100μL中含SW620細(xì)胞數(shù)：0，1，2，4，8，16，32，64，128，256），在ACEA Quanteon流式細(xì)胞儀上中速采集100μL，記錄EpCAM+細(xì)胞數(shù)量。A. 設(shè)門策略。FSC-SSC散點(diǎn)圖上設(shè)P1門去除碎片和雜信號(hào)，基于P1門，在散點(diǎn)圖上表現(xiàn)為EpCAM+的細(xì)胞即為摻入的SW620細(xì)胞；B. ACEA Quanteon流式細(xì)胞儀上的測(cè)試結(jié)果；

結(jié)論
ACEA Quanteon流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同細(xì)胞數(shù)量摻入水平，實(shí)際檢出細(xì)胞數(shù)量與理論數(shù)量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，靈敏度為0.0001%，即可檢測(cè)到10⁶個(gè)正常人白細(xì)胞中的1個(gè)腫瘤細(xì)胞，證明ACEA Quanteon流式細(xì)胞儀在檢測(cè)CTCs方面具有高靈敏度。

參考文獻(xiàn)

[1] 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與臨床應(yīng)用進(jìn)展。趙倩雯，司徒博，鄭 磊。南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 37(10): 1423-1426

[2] 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展。王宜文，胡孔旺。安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52(12)：1897-1900

*文章來(lái)自艾森生物

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