該團(tuán)隊(duì)先前的研究揭示gga-miR-375在禽類白血病病毒J亞群(ALV-J)感染的雞肝臟腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)合當(dāng)下的研究熱點(diǎn)認(rèn)為gga-miR-375可能與circRNA有關(guān)。在本研究中，環(huán)狀RNA測(cè)序結(jié)果顯示，在感染ALV-J的雞肝臟腫瘤中，circ-Vav3顯著上調(diào)。進(jìn)一步通過(guò)RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ-Vav3是gga-miR-375的海綿。此外，研究者通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且進(jìn)一步驗(yàn)證了circ-Vav3通過(guò)海綿吸附作用釋放gga-miR-375的靶基因YAP1，進(jìn)而通過(guò)circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并在臨床樣本中得到了驗(yàn)證。

研究?jī)?nèi)容：
1.circRNA表達(dá)譜及其結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

研究人員以ALV-J感染的雞肝為測(cè)序樣本，通過(guò)環(huán)狀RNA測(cè)序（由云序生物提供）檢測(cè)到有2822個(gè)circRNAs呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其中2808個(gè)circRNAs顯著性上調(diào)。并通過(guò)聚類圖、火山圖和散點(diǎn)圖對(duì)25種表達(dá)上調(diào)的circRNAs進(jìn)行生信分析，發(fā)現(xiàn)circ-Vav3上調(diào)最顯著。此外，該團(tuán)隊(duì)先前的研究揭示了同樣的樣本中g(shù)ga-miR-375下調(diào)最明顯。接下來(lái)利用TargetScan和miRanda軟件對(duì)25種circRNAs可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行生信預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其中circ-Vav3與gga-miR-375結(jié)合的評(píng)分最高。

2.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375

circ-Vav3的命名主要是基于該環(huán)狀RNA來(lái)源于Vav3基因的8-11號(hào)外顯子；預(yù)測(cè)結(jié)果顯示circ-Vav3與gga-miR-375之間存在完美的靶向位點(diǎn)。利用海綿機(jī)制指示蛋白進(jìn)行AGO2 RIP實(shí)驗(yàn)（由云序生物提供），對(duì)捕獲的AGO2蛋白進(jìn)行qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)circ-Vav3與gga-miR-375顯著富集；同時(shí)利用circ-Vav3探針進(jìn)行RNA pull down實(shí)驗(yàn)（由云序生物提供）檢測(cè)出了gga-miR-375的結(jié)合情況。RNA-FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circ-Vav3主要存在細(xì)胞質(zhì)，而gga-miR-375即存在于細(xì)胞質(zhì)又存在于細(xì)胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通過(guò)相互結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。

3.gga-miR-373 通過(guò)與YAP1的3’UTR區(qū)結(jié)合負(fù)調(diào)控YAP1的表達(dá)，并且過(guò)表達(dá)gga-miR-375可減弱EMT

生信預(yù)測(cè)揭示YAP1是gga-miR-375的潛在靶基因，進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)了gga-miR-375可通過(guò)結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)抑制YAP1的表達(dá)；在體外細(xì)胞系DF-1中過(guò)表達(dá)gga-miR-375可明顯下調(diào)YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通過(guò)直接結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)，抑制YAP1基因的表達(dá)。EMT現(xiàn)象是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前兆，該過(guò)程伴隨著關(guān)鍵基因的上調(diào)（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下調(diào)（E-cadherin）。通過(guò)過(guò)表達(dá)gga-miR-375發(fā)現(xiàn)可以顯著上調(diào)EMT正相關(guān)的基因的mRNA和蛋白水平，下調(diào)負(fù)相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平，并且證明了EMT相關(guān)基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通過(guò)抑制YAP1基因的表達(dá)間接抑制EMT的進(jìn)程。

4.YAP1過(guò)表達(dá)促進(jìn)EMT，使細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)

研究者進(jìn)一步通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)證明了過(guò)表達(dá)YAP1可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)qPCR和WB也證實(shí)在YAP1過(guò)表達(dá)的DF-1細(xì)胞系中，EMT相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)情況發(fā)生了明顯的改變，說(shuō)明YAP1可促進(jìn)EMT的發(fā)生和細(xì)胞遷移能力。

5.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375上調(diào)靶基因YAP1從而促進(jìn)EMT

經(jīng)過(guò)前期工作的積累，研究人員認(rèn)為circ-Vav3在胞漿中海綿吸附gga-miR-375，從而上調(diào)YAP1和EMT相關(guān)基因的表達(dá)。共表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，相對(duì)于過(guò)表達(dá)gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空載組），而過(guò)表達(dá)gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（實(shí)驗(yàn)組）的EMT正相關(guān)基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明顯上調(diào)，而負(fù)相關(guān)基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明顯下調(diào)；更加證實(shí)了circ-Vav3通過(guò)海綿作用吸附gga-miR-375，上調(diào)其靶基因YAP1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。

6.ALV-J感染細(xì)胞系和臨床樣本的驗(yàn)證

利用ALV-J病毒株感染DF-1細(xì)胞系后，利用WB和qPCR技術(shù)手段進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中circ-Vav3表達(dá)顯著上調(diào)，gga-miR-375表達(dá)顯著下調(diào)；同時(shí)，YAP1和EMT正相關(guān)基因的蛋白和mRNA水平也顯著的上調(diào)，相反的，EMT負(fù)相關(guān)基因的蛋白和mRNA水平則顯著下調(diào)。從養(yǎng)雞場(chǎng)獲取的感染ALV-J的雞的肝樣本，進(jìn)行相同的檢測(cè)，得到了相同的結(jié)果，進(jìn)一步夯實(shí)了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

總結(jié)：
“一站到底”！云序生物環(huán)狀RNA研究從做譜（環(huán)狀RNA測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、環(huán)狀RNA甲基化測(cè)序）到機(jī)制研究（RNA pull down、RIP），為您全方位的覆蓋差異環(huán)狀RNA分子篩選到下游分子機(jī)制驗(yàn)證的重要研究環(huán)節(jié)。此外，云序生物自行建立并維護(hù)的環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(kù)circDB憑借物種覆蓋廣、數(shù)據(jù)量大、疾病背景多的特點(diǎn)，支持許多客戶發(fā)表環(huán)狀RNA成果。在過(guò)去的時(shí)間里云序生物和各位生命科學(xué)領(lǐng)域的專家學(xué)者、醫(yī)護(hù)工作者共同進(jìn)步成長(zhǎng)，探索未知的奧秘。回首過(guò)去，從表觀遺傳學(xué)到表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)，從基因組到蛋白質(zhì)組，從細(xì)胞內(nèi)到外泌體，云序生物依托于高通量測(cè)序技術(shù)為越來(lái)越多的臨床與基礎(chǔ)生物研究者提供了高質(zhì)量的科研服務(wù)。在我們的共同努力下，云序客戶發(fā)表越來(lái)越多的高分文章。
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