潮汐反應(yīng)器技術(shù)在以VERO細(xì)胞為載體生產(chǎn)日本腦炎病毒(JEV)疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用

 

背景介紹

 

日本腦炎病毒（JEV）于1934年首次從一例致命的人類病例的大腦中分離出來。雖然有癥狀的日本腦炎很少見，但病死率可高達(dá)30%。在那些幸存下來的人當(dāng)中，30-50%遭受性的智力、行為或神經(jīng)問題。東南亞和西太平洋地區(qū)有30多億人可能受到JEV感染，因此接種疫苗是預(yù)防措施。

 

日本腦炎疫苗的開發(fā)始于20世紀(jì)40年代福爾馬林滅活小鼠腦源性疫苗。盡管在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答方面有效，但最后一批小鼠源疫苗已于2011年5月用完，因?yàn)楫?dāng)今國(guó)際乙腦疫苗開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)不再允許這種生產(chǎn)方法。

 

在這篇白皮書中，我們描述了使用填充床細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)開發(fā)日本腦炎疫苗的過程。我們提供了一種具有成本效益的生物處理解決方案和一種適用于替代小鼠腦源性疫苗的制造工藝。

 

 

概述

 

使用含有胎牛血清的MEM培養(yǎng)基,將VERO細(xì)胞接種在充滿片狀載體（BioNOCⅡ）的500mL潮汐式生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（VacciXcell CelCradle-500AP）。在接種培養(yǎng)96小時(shí)后，可以收獲的細(xì)胞數(shù)量為1.2x10⁹。在培養(yǎng)倍增時(shí)間方面，細(xì)胞在潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle (CC)上培養(yǎng)需要32小時(shí)，而在T-175培養(yǎng)瓶上則需要40小時(shí)。這一數(shù)據(jù)結(jié)果清楚地說明了潮汐式生物反應(yīng)器技術(shù)能夠?yàn)榧?xì)胞提供更好的生長(zhǎng)條件，原因是此項(xiàng)技術(shù)增加了細(xì)胞和培養(yǎng)基之間營(yíng)養(yǎng)成分以及氧氣的有效交換。

 

使用日本腦炎病毒株以感染倍數(shù)(multiplicity-of-infection MOI) 0.01感染VERO細(xì)胞。在病毒感染后，每天收獲一部分病毒液，并補(bǔ)充等量新鮮培養(yǎng)基，能連續(xù)培養(yǎng)收獲超過7天的病毒液。收獲液的病毒滴度采用“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，即斑檢測(cè)法（Plaque Assay）為檢測(cè)病毒感染顆粒滴度的方法測(cè)定。最終，1臺(tái)潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle能可獲收1.11x10¹¹ plaque-forming unit (pfu)總體病毒滴度。

 

材料

 

設(shè)備	細(xì)胞系/產(chǎn)品	完全培養(yǎng)基	接種細(xì)胞數(shù)
Celcradle - 500 AP	VERO細(xì)胞系/ JEV	MEM/ 10%FBS/ 2mM L-Glutamine	1.4 x108

 

表1：執(zhí)行階段-Vero單元擴(kuò)展所需的材料.

 

 

 

階段:Vero細(xì)胞的接種和增殖

 

使用胰蛋白酶消化法從4個(gè)T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶上收獲細(xì)胞，收集起來，400 x g，3 min離心洗滌，共收獲1.4x10⁸個(gè)細(xì)胞，添加120ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶白帽的潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle- 500AP一次性培養(yǎng)瓶中。將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置，進(jìn)行細(xì)胞貼壁接種，注意要使片狀載體全部浸沒于細(xì)胞懸液中。將培養(yǎng)瓶置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)，每15-30分鐘拿出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖晃，使細(xì)胞均勻接觸營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣。1小時(shí)后，播種效率達(dá)99.51%。為使附著細(xì)胞增殖，向培養(yǎng)瓶添加培養(yǎng)基體積達(dá)500mL，與裝有2.2 L培養(yǎng)基的灌注瓶連接，置于平臺(tái)上，參數(shù)設(shè)置如下:

 

CelCradle培養(yǎng)基體積	TideMotion潮汐式的參數(shù)	增殖周期
500mL	Uprate: 1 mm/sec Uphold: 10 sec Downrate: 1 mm/sec Downhold: 10 sec	96小時(shí) (4天)
灌注瓶培養(yǎng)基體積	灌注參數(shù)
2200mL	Pump 1 Volume: 1999 ml Cycles/Day: 24 Schedule: 1111111

 

表2：階段celbradle階段生長(zhǎng)和灌注參數(shù)概述：vero細(xì)胞擴(kuò)展

 

 

每天取載體進(jìn)行:(1)CVD計(jì)數(shù);(2)甲醇/臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞增殖及在基質(zhì)中的分布。

 

圖1:(頂部)每天使用CVD對(duì)CelCradle-500AP瓶中至少10個(gè)隨機(jī)選擇的載體進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(下):固定3個(gè)載體甲醇，RTP染色1x臺(tái)盼藍(lán)染色5min, PBS沖洗2次，顯微鏡下觀察。

 

 

第二階段:病毒接種和傳播

 

VERO細(xì)胞感染JEV, MOI為0.01，總體積為500ml。病毒接種及7天傳播參數(shù)如下:

 

表3：執(zhí)行第二階段的CelCradle階段參數(shù)概述。

 

 

采集含有病毒產(chǎn)品的培養(yǎng)基，并在七天的不同時(shí)間用新鮮培養(yǎng)基替換:

表4：第二階段七天內(nèi)收獲和新鮮介質(zhì)補(bǔ)充時(shí)間點(diǎn)一覽表。

 

圖2: (上)每天用葡萄糖細(xì)胞儀測(cè)量血糖濃度。藍(lán)色箭頭表示上清液收獲(470mL)與相同數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基更換。葡萄糖[G;綠色字體]及/或谷氨酰胺[Glut;綠色字體]及/或碳酸氫鈉[SB;紫色字體)。(下) :0dpi和7dpi隨機(jī)從CelCradle瓶中抽取3片載體。使用甲醇固定，添加1x臺(tái)盼藍(lán)，染色5min,快速熱處理， PBS沖洗2次，在顯微鏡下觀察。

 

 

第三階段: 斑檢測(cè)法（Plaque Assay）測(cè)量JEV毒液滴度

 

從感染后的第2天到第7天，每天采集含病毒上清液。完成的收獲之后，將含病毒上清液保存在-80°C。病毒滴度分析測(cè)定使用“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，即斑檢測(cè)法，或者其它已經(jīng)公布開放了的方案。

圖3:CelCradle-500 AP，斑塊形成單位的滴度(感染性JEV)。

 

表5CelCradle - 500 A，收獲液的滴度(感染性JEV)。

 

2D和3D細(xì)胞培養(yǎng):病毒生產(chǎn)量的比較

 

對(duì)比二維培養(yǎng)如T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及三維培養(yǎng)如潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle，對(duì)病毒的繁殖生產(chǎn)的影響，一個(gè)潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle細(xì)胞培養(yǎng)瓶生產(chǎn)的JEV含量相當(dāng)于21個(gè)T-175細(xì)胞培養(yǎng)瓶生產(chǎn)的JEV病毒滴度含量。

 

討論

 

      潮汐式生物反應(yīng)器技術(shù)能確保細(xì)胞的高密度擴(kuò)增、增殖以及最終收獲產(chǎn)品的高產(chǎn)。它的獨(dú)特之處在于創(chuàng)造了一個(gè)結(jié)合高氧傳遞和低剪切力的利于貼壁細(xì)胞增殖的環(huán)境。預(yù)期的優(yōu)良藥品制作規(guī)范生產(chǎn)模式制生產(chǎn)（Good Manufacturing Practice）量將要求達(dá)到一個(gè)500L的生物反應(yīng)器規(guī)模，并且還需要更加廣泛性的優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以降低產(chǎn)品成品，增加產(chǎn)品產(chǎn)量，另外，還需要確定關(guān)鍵的工藝參數(shù)，以提高GMP模式制生產(chǎn)過程水平。在這里，由于潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle采用了大型潮汐式生物反應(yīng)器TideCell相同的潮汐反應(yīng)技術(shù)原理，并且因其占地面積小且體積小，可以更加靈活地應(yīng)用于生產(chǎn)工藝的優(yōu)化以及新工藝的開發(fā)。

 

     在這項(xiàng)概念性驗(yàn)證研究中，我們已經(jīng)證明潮汐式生物反應(yīng)器CelCradle-500AP可以應(yīng)用于Vero細(xì)胞的培養(yǎng)和JEV疫苗生產(chǎn)工藝。1個(gè)潮汐式生物反應(yīng)器CC-500AP培養(yǎng)瓶的總病毒產(chǎn)量為1.06x10¹¹ pfu (plaque assay));然而，一個(gè)潮汐式生物反應(yīng)器CC-500AP培養(yǎng)瓶的體積與一個(gè)T-175培養(yǎng)瓶相似，但前者的病毒產(chǎn)量是后者的21倍的。值得注意的是，在未優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，依然收獲了滴度如此高的終產(chǎn)品，繼續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以預(yù)料會(huì)收獲更加令人振奮的結(jié)果，后續(xù)的試驗(yàn)將進(jìn)一步探索以及確定Vero細(xì)胞培養(yǎng)和JEV生產(chǎn)工藝的的操作參數(shù)以便可以提高產(chǎn)量。

 

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