石蠟切片抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）免疫組化染色試劑盒
 
主要用途
 
石蠟切片抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）免疫組化染色試劑是一種旨在使用標(biāo)準化的化學(xué)分離石蠟方法和免疫抗體顯色技術(shù)，即通過抗酒石酸酸性磷酸酶多克隆抗體以及辣根過氧化物酶綴合物二抗，使用染料二氨基聯(lián)苯胺染色顯示棕褐色，分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中酒石酸酸性磷酸酶表達和分布狀況的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于石蠟包埋的各種人體、大鼠、小鼠等破骨組織細胞抗酒石酸酸性磷酸酶表達分析�？捎糜诠琴|(zhì)細胞病理生理的研究的鑒定。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，顯色清晰，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
 
技術(shù)背景
 
抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP）是一種在哺乳動物內(nèi)表達的糖化單體金屬蛋白酶，970多堿基，320多氨基酸，分子量為35kD。作為破骨細胞的標(biāo)志，抗酒石酸酸性磷酸酶與破骨細胞調(diào)節(jié)的骨再吸收（resorption）活性和骨生成代謝有關(guān)�？咕剖�酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通過蛋白酶裂解和還原后活化。在酸性環(huán)境下，催化磷酸酯鍵的水解，產(chǎn)生醇和釋放磷酸。其特征性為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區(qū)別。抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨細胞（osteoclast）、活化的巨噬細胞、神經(jīng)細胞以及懷孕期的豬內(nèi)皮層子宮內(nèi)膜（endometrium）高度表達。在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛細胞性白血病（hairy cell leukaemia）、戈謝�。℅aucher’s disease）、愛茲性腦病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨細胞瘤（osteoclastoma）、骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）和代謝性骨病等病人體內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶顯著增高。 通過抗酒石酸酸性磷酸酶多克隆抗體以及辣根過氧化物酶綴合物二抗（Peroxidase conjugated antibody）反應(yīng)，進而使用染料二氨基聯(lián)苯胺染色顯示抗酒石酸酸性磷酸酶表達陽性破骨細胞為棕褐色。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
脫蠟液（Reagent A）         300毫升（自備）
補水液A（Reagent B）  100毫升
補水液B（Reagent C）  100毫升
補水液C（Reagent D）  100毫升
補水液D（Reagent E）  100毫升
清理液（Reagent F）  120毫升
修復(fù)液（Reagent G）   2毫升
封阻液（Reagent H）   4毫升
一抗液（Reagent I）   1毫升
二抗液（Reagent J）   1毫升
顯色液A（Reagent K） 500微升
顯色液B（Reagent L）   5毫升
產(chǎn)品說明書   1份
 
保存方式
 
保存修復(fù)液（Reagent G）、一抗液（Reagent I）、二抗液（Reagent J）和顯色液A（Reagent K）在－20℃冰箱里，嚴格避免反復(fù)凍融，其余的保存在4℃冰箱里；二抗液（Reagent J）和顯色液A（Reagent K），避免光照；有效保證3月
 
用戶自備
 
小型染色缸：用于石蠟切片的脫蠟和染色操作
蓋玻片：用于抗體孵育操作
光學(xué)顯微鏡：用于細胞染色后觀察分析
 
特別注意
 

• 顯色液A（Reagent K）和顯色液B（Reagent L）必須在實驗操作前即刻混勻；混勻后切忌久放不用或儲存后備用；用完扔掉
• 顯色液A（Reagent K）如果出現(xiàn)沉淀，須過濾后再用

 
實驗步驟
 

• 脫蠟處理

 

• 取出10片4至10微米厚的待測石蠟包埋的組織切片（注意：石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時，此步很重要）
• （選擇步驟）放進80℃烘箱，孵育30分鐘
• （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘
• 按下表依次放進小染色缸里孵育

染色缸	孵育時間
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升補水液A（Reagent B）	3分鐘
50毫升補水液B（Reagent C）	3分鐘
50毫升補水液C（Reagent D）	3分鐘
50毫升補水液D（Reagent E）	3分鐘

 

• 小心移去切片上的補水液D（Reagent E）
• 小心加上200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘

小心移去切片上的清理液（Reagent F）
二、樣本修復(fù)處理

• 小心加上200微升修復(fù)液（Reagent G），鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去切片上的修復(fù)液（Reagent G）
• 室溫下，將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育5分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）
• 小心加上200微升封阻液（Reagent H），鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘
• 小心移去切片上的封阻液（Reagent H）
• 室溫下，將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育5分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

 

• 免疫標(biāo)記處理

 

• 小心加上100微升含有一抗液（Reagent I），鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下，孵育1小時，保持濕潤，避免干燥（注意：可以使用蓋玻片蓋上孵育）
• 小心移去切片上的一抗液（Reagent I）
• 室溫下，小心將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

 
四、樣本染色處理
 
在染色前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的顯色液A（Reagent K）置入冰槽里融化，然后移取200微升顯色液A（Reagent K）和1.8毫升顯色液B（Reagent L）到2毫升離心管，充分混勻，標(biāo)記為顯色工作液，置于暗室。然后進行下列操作：
 

• 小心加上100微升二抗液（Reagent J）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面（注意：可以使用蓋玻片蓋上孵育）
• 室溫下孵育30分鐘，避免光照
• 小心移去切片上的二抗液（Reagent J）
• 室溫下，小心將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）
• 小心加上200微升含有顯色液A（Reagent K）和顯色液B（Reagent L）的顯色工作液，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育5至60分鐘，或直至樣本出現(xiàn)棕褐色
• 小心移去切片上含有顯色液A（Reagent K）和顯色液B（Reagent L）的顯色工作液
• 室溫下，小心將切片置入50毫升清理液（Reagent F）中浸泡5秒
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）
• （選擇步驟）進行甲基綠或蘇木素復(fù)染（注意：建議使用甲基綠復(fù)染試劑盒－YJ40010）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：陽性細胞呈現(xiàn)棕褐色

 
注意事項
 

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 操作時須戴手套，以防污染
• 脫蠟液（Reagent A）可以使用二甲苯替代
• 清理液（Reagent F）50毫升置于小型染色缸里，可重復(fù)使用
• 所有操作在室溫下進行
• 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干�？諝庵辛栏蔂顟B(tài)為沒有水滴，呈濕潤狀態(tài)，可見反光
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 細胞顯色，避免過度，密切目測觀察，控制時間
• 細胞顯色完成后，即刻進行光學(xué)顯微鏡觀察
• 本公司提供系列破骨細胞檢測試劑產(chǎn)品

 
質(zhì)量標(biāo)準
 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰