circRNA_104075在促進(jìn)肝癌發(fā)生和進(jìn)展的機制研究
circRNA_104075海綿吸附靶向抑制YAP表達(dá)的miR-582-3p從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和進(jìn)展
文章導(dǎo)讀：
在全球范圍內(nèi)原發(fā)性肝癌是造成癌癥相關(guān)死亡的三大原因之一。肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟癌癥。由于缺乏高特異性和敏感性的早期診斷生物標(biāo)志物，HCC患者往往得不到及時有效的治療。相比于長鏈非編碼RNA和miRNA，circRNA作為一種新型環(huán)狀RNA，具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在組織和血液中具有高度穩(wěn)定表達(dá)和存在的特點。并且已有研究證明circRNA在多種疾病發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，且可以作為高特異性和敏感性的生物標(biāo)志物應(yīng)用于早期的臨床診斷中，具有很好的應(yīng)用前景。此外，m6A RNA甲基化修飾是哺乳動物中最豐富的RNA修飾類型。它在RNA的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮著多種作用，包括mRNA的穩(wěn)定性、選擇性剪接和miRNA的成熟過程。m6A修飾還可以調(diào)節(jié)甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，阻止或誘導(dǎo)其他RNA的結(jié)合。
文章內(nèi)容：
1. circ_104075在HCC組織中高表達(dá)
該團(tuán)隊首先對先前已經(jīng)報道過的三個HCC組織中circRNA表達(dá)數(shù)據(jù)(云序生物提供環(huán)狀RNA測序服務(wù))進(jìn)行合并分析，篩選到了一個高表達(dá)的環(huán)狀RNA分子，即circ_104075。并且與正常的癌旁組織相比，HCC中circ_104075明顯高表達(dá)。同時與其他先前研究報道過的HCC血清診斷標(biāo)志物（DANCR, HULC, UCA1, miR-21 和 miR-223）相比，HCC患者中circ_104075表達(dá)上調(diào)的水平更顯著。
圖1. 肝癌患者circ_104075表達(dá)上調(diào)
2. HCC中circ_104075表達(dá)受HNF4a正調(diào)控
作者選擇了一些公認(rèn)的HCC致癌的轉(zhuǎn)錄因子，通過敲除和過表達(dá)發(fā)現(xiàn)在這些轉(zhuǎn)錄因子中只有HNF4a的表達(dá)與circ_104075的表達(dá)正相關(guān)。相比于正常小鼠，HNF4a敲除小鼠肝的大小和重量明顯減少，同時circ_104075的表達(dá)也明顯降低；臨床HCC組織分析發(fā)現(xiàn)HCC患者中HNF4a的表達(dá)水平也是明顯上調(diào)，進(jìn)一步證實了HNF4a的表達(dá)與circ_104075的表達(dá)成正相關(guān)的結(jié)論。
作者選擇了一些公認(rèn)的HCC致癌的轉(zhuǎn)錄因子，通過敲除和過表達(dá)發(fā)現(xiàn)在這些轉(zhuǎn)錄因子中只有HNF4a的表達(dá)與circ_104075的表達(dá)正相關(guān)。相比于正常小鼠，HNF4a敲除小鼠肝的大小和重量明顯減少，同時circ_104075的表達(dá)也明顯降低；臨床HCC組織分析發(fā)現(xiàn)HCC患者中HNF4a的表達(dá)水平也是明顯上調(diào)，進(jìn)一步證實了HNF4a的表達(dá)與circ_104075的表達(dá)成正相關(guān)的結(jié)論。
圖2. circ_104075表達(dá)受HNF4a正向調(diào)控
3. HNF4a是如何調(diào)控circ_104075的表達(dá)的？
為了驗證轉(zhuǎn)錄因子HNF4a是如何調(diào)控circ_104075表達(dá)的，作者通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)HNF4a可以結(jié)合circ_104075啟動子（-1482 to -1296）的位點；接著利用ChIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）捕獲HNF4a沉淀復(fù)合物后，在HCC組織和HCC細(xì)胞系中都發(fā)現(xiàn)了HNF4a可以結(jié)合circ_104075啟動子（-1482 to -1296）的位點；熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實了過表達(dá)HNF4a可以明顯促進(jìn)circ_104075啟動子的熒光素酶活性，而敲低HNF4a表達(dá)抑制circ_104075啟動子的熒光素酶活性；如果突變circ_104075啟動子上HNF4a結(jié)合位點，過表達(dá)或者敲低HNF4a表達(dá)則對其熒光素酶活性無明顯影響，揭示HNF4a通過結(jié)合circ_104075啟動子，正向調(diào)控其表達(dá)。
為了驗證轉(zhuǎn)錄因子HNF4a是如何調(diào)控circ_104075表達(dá)的，作者通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)HNF4a可以結(jié)合circ_104075啟動子（-1482 to -1296）的位點；接著利用ChIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）捕獲HNF4a沉淀復(fù)合物后，在HCC組織和HCC細(xì)胞系中都發(fā)現(xiàn)了HNF4a可以結(jié)合circ_104075啟動子（-1482 to -1296）的位點；熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實了過表達(dá)HNF4a可以明顯促進(jìn)circ_104075啟動子的熒光素酶活性，而敲低HNF4a表達(dá)抑制circ_104075啟動子的熒光素酶活性；如果突變circ_104075啟動子上HNF4a結(jié)合位點，過表達(dá)或者敲低HNF4a表達(dá)則對其熒光素酶活性無明顯影響，揭示HNF4a通過結(jié)合circ_104075啟動子，正向調(diào)控其表達(dá)。
圖3. HNF4a結(jié)合circ_104075的啟動子
4. circ_104075促進(jìn)YAP（致癌信號通路）的表達(dá)
接下來，作者探究了circ_104075在HCC中可以調(diào)控哪些致癌信號通路。通過敲除和過表達(dá)circ_104075后發(fā)現(xiàn)，只有YAP所涉及的相關(guān)促進(jìn)HCC的信號通路的改變，YAP與circ_104075的表達(dá)呈正相關(guān)，并且YAP是公認(rèn)的HCC促進(jìn)因子。臨床驗證也同樣揭示了YAP的表達(dá)與circ_104075的表達(dá)呈正相關(guān)的結(jié)論。
接下來，作者探究了circ_104075在HCC中可以調(diào)控哪些致癌信號通路。通過敲除和過表達(dá)circ_104075后發(fā)現(xiàn)，只有YAP所涉及的相關(guān)促進(jìn)HCC的信號通路的改變，YAP與circ_104075的表達(dá)呈正相關(guān)，并且YAP是公認(rèn)的HCC促進(jìn)因子。臨床驗證也同樣揭示了YAP的表達(dá)與circ_104075的表達(dá)呈正相關(guān)的結(jié)論。
圖4. circ_104075正調(diào)控YAP表達(dá)
5. circ_104075可以結(jié)合miR-582-3p
作者首先想到circRNA通過海綿作用吸附miRNA，直接調(diào)控靶蛋白的表達(dá)，作者利用miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測了circ_104075最有可能結(jié)合的5個miRNA，接著通過RNA pull down技術(shù)（云序生物提供此項實驗）捕獲復(fù)合物后RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)只有miR-582-3p存在結(jié)合；通過構(gòu)建突變形式circ_104075和miR-582-3p，熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了WT circ_104075和WT miR-582-3p的結(jié)合，WT miR-582-3p可以抑制WT-、Mut1-和Mut2- circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075該結(jié)合位點的5’和3’端序列對于miR-582-3p的結(jié)合至關(guān)重要。同時Mut miR-582-3p則無法抑制circ_104075的酶活性。
作者首先想到circRNA通過海綿作用吸附miRNA，直接調(diào)控靶蛋白的表達(dá)，作者利用miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測了circ_104075最有可能結(jié)合的5個miRNA，接著通過RNA pull down技術(shù)（云序生物提供此項實驗）捕獲復(fù)合物后RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)只有miR-582-3p存在結(jié)合；通過構(gòu)建突變形式circ_104075和miR-582-3p，熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了WT circ_104075和WT miR-582-3p的結(jié)合，WT miR-582-3p可以抑制WT-、Mut1-和Mut2- circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075該結(jié)合位點的5’和3’端序列對于miR-582-3p的結(jié)合至關(guān)重要。同時Mut miR-582-3p則無法抑制circ_104075的酶活性。
圖5. circ_104075直接結(jié)合miR-582-3p
6. miR-582-3p可以靶向結(jié)合YAP-3’UTR
已經(jīng)證實了circ_104075可以結(jié)合miR-582-3p，同時circ_104075與YAP表達(dá)成正相關(guān)，那么問題來了，miR-582-3p是否靶向調(diào)控YAP表達(dá)呢？進(jìn)一步研究證實了miR-582-3p表達(dá)與YAP表達(dá)的負(fù)相關(guān)性， 通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-582-3p的5’端可以結(jié)合YAP mRNA 的3’UTR的三個位點，對這三個位點進(jìn)行突變后進(jìn)行熒光素酶報告基因?qū)嶒�，發(fā)現(xiàn)miR-582-3p無法抑制Mut1-YAP-3’UTR，說明YAP mRNA 的3’UTR（315-321堿基序列）對于miR-582-3p的5’端的結(jié)合很重要；通過敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，證明了miR-582-3p在circ_104075促進(jìn)YAP表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。
已經(jīng)證實了circ_104075可以結(jié)合miR-582-3p，同時circ_104075與YAP表達(dá)成正相關(guān)，那么問題來了，miR-582-3p是否靶向調(diào)控YAP表達(dá)呢？進(jìn)一步研究證實了miR-582-3p表達(dá)與YAP表達(dá)的負(fù)相關(guān)性， 通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-582-3p的5’端可以結(jié)合YAP mRNA 的3’UTR的三個位點，對這三個位點進(jìn)行突變后進(jìn)行熒光素酶報告基因?qū)嶒�，發(fā)現(xiàn)miR-582-3p無法抑制Mut1-YAP-3’UTR，說明YAP mRNA 的3’UTR（315-321堿基序列）對于miR-582-3p的5’端的結(jié)合很重要；通過敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，證明了miR-582-3p在circ_104075促進(jìn)YAP表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。
圖6. YAP-3’UTR是miR-582-3p的靶點
7. YAP-3’UTR的m6A修飾水平促進(jìn)miR-582-3p的結(jié)合
通過MeRIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）檢測到了P1-YAP-3’UTR (235-419 堿基序列)的表達(dá)上調(diào)，而該區(qū)域?qū)τ趍iR-582-3p的結(jié)合也很重要。YAP-3’UTR （235-419區(qū)域）中的353-357區(qū)域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通過突變這位點堿基后過表達(dá)進(jìn)行MeRIP-qPCR，發(fā)現(xiàn)只有不突變最后三個堿基ACU的YAP-3’UTR的m6A修飾水平不會降低。同時熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實了YAP-3’UTR 353-357區(qū)域的AGACU對于miR-582-3p結(jié)合后發(fā)揮抑制功能來說是至關(guān)重要的。臨床組織樣本的MeRIP-qPCR也證實了HCC患者組織的YAP-3’UTR 353-357區(qū)域的m6A修飾水平明顯降低，與HCC患者的YAP表達(dá)上調(diào)存在一致性。
通過MeRIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）檢測到了P1-YAP-3’UTR (235-419 堿基序列)的表達(dá)上調(diào)，而該區(qū)域?qū)τ趍iR-582-3p的結(jié)合也很重要。YAP-3’UTR （235-419區(qū)域）中的353-357區(qū)域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通過突變這位點堿基后過表達(dá)進(jìn)行MeRIP-qPCR，發(fā)現(xiàn)只有不突變最后三個堿基ACU的YAP-3’UTR的m6A修飾水平不會降低。同時熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實了YAP-3’UTR 353-357區(qū)域的AGACU對于miR-582-3p結(jié)合后發(fā)揮抑制功能來說是至關(guān)重要的。臨床組織樣本的MeRIP-qPCR也證實了HCC患者組織的YAP-3’UTR 353-357區(qū)域的m6A修飾水平明顯降低，與HCC患者的YAP表達(dá)上調(diào)存在一致性。
圖7. YAP-3’UTR中的m6A修飾促進(jìn)了其與miR-582-3p的相互作用
8. circ_104075在HCC中的臨床診斷意義
通過對一系列消化系統(tǒng)疾病的分析發(fā)現(xiàn)，相對于其他消化系統(tǒng)癌癥， circ_104075在HCC患者血清中高表達(dá)是具有特異性的，并且隨著HCC的進(jìn)展呈現(xiàn)正相關(guān)性，同時手術(shù)治療后HCC患者血清中的circ_104075表達(dá)水平明顯降低；ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，相對于HCC中其他一些應(yīng)用的生物標(biāo)志物來說，血清circ_104075表達(dá)水平具有更高的敏感性和特異性，提示其可作為診斷HCC的生物標(biāo)志物從而應(yīng)用于臨床中(云序生物提供環(huán)狀RNA實時定量PCR服務(wù))。
通過對一系列消化系統(tǒng)疾病的分析發(fā)現(xiàn)，相對于其他消化系統(tǒng)癌癥， circ_104075在HCC患者血清中高表達(dá)是具有特異性的，并且隨著HCC的進(jìn)展呈現(xiàn)正相關(guān)性，同時手術(shù)治療后HCC患者血清中的circ_104075表達(dá)水平明顯降低；ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，相對于HCC中其他一些應(yīng)用的生物標(biāo)志物來說，血清circ_104075表達(dá)水平具有更高的敏感性和特異性，提示其可作為診斷HCC的生物標(biāo)志物從而應(yīng)用于臨床中(云序生物提供環(huán)狀RNA實時定量PCR服務(wù))。
圖8. 血清circ_104075可作為HCC診斷的生物標(biāo)志物
綜上所述，該研究闡明了circ_104075在HCC中上調(diào)的機制以及其下游調(diào)控HCC腫瘤發(fā)生的機制。并且揭示circ_104075可以作為一種新的肝癌診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。
全文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41419-018-1132-6
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