Nature | SMAD2/3與TGF-β通路協(xié)同影響轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生m6A RNA甲基化調(diào)控干細(xì)胞發(fā)育
 

文章導(dǎo)讀：
胚胎干細(xì)胞作為一種全能性細(xì)胞，通過(guò)增殖和分化，產(chǎn)生動(dòng)物體所有組織和器官的細(xì)胞。已有研究表明，胚胎干細(xì)胞發(fā)生m6A RNA甲基化，大多與細(xì)胞增殖[1-2]，免疫應(yīng)答[4]關(guān)系密切。然而，對(duì)于m6A修飾在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)胚層細(xì)胞分化過(guò)程中的分子機(jī)制目前并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。今天，分享一篇英國(guó)劍橋大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)于2018年8月發(fā)表在Nature（影響因子：40.14）文章，聊一聊RNA甲基化在調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制。這篇文章的開(kāi)頭很直接，首先通過(guò)閱讀文獻(xiàn)確定了感興趣的基因SMAD2/3，對(duì)其進(jìn)行Co-IP和質(zhì)譜后，結(jié)果顯示其能夠與甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3，METTL14和WTAP直接互作。他們是明星，和他們結(jié)合的分子也是明星分子，這不，在胚胎干細(xì)胞當(dāng)中有研究者就發(fā)現(xiàn)SMAD2/3就和METTL3，METTL14結(jié)合，不出所料，這一結(jié)合在胚胎干細(xì)胞當(dāng)中起到了重要作用。

文章內(nèi)容：
1.SMAD2/3蛋白與METTL3-METTL14-WTAP復(fù)合物結(jié)合
作者首先通過(guò)體外刺激，誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)外胚層細(xì)胞，并通過(guò)Co-IP技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜（云序生物提供此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)）技術(shù)，對(duì)比兩種細(xì)胞中，能夠與SMAD2/3抗體直接結(jié)合的蛋白。結(jié)果顯示，一共找到89個(gè)蛋白，取交集后，得到78個(gè)共有蛋白，繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)這些蛋白除參與TGF-β信號(hào)通路，mRNA生物學(xué)過(guò)程之外，還與國(guó)自然大熱點(diǎn)RNA甲基化中的甲基化轉(zhuǎn)移酶-------METTL3-METTL14-WTAP復(fù)合物直接互作。此結(jié)果與后期WB驗(yàn)證和抑制SMAD2/3磷酸化位點(diǎn)后Co-IP結(jié)果吻合。PLA實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者間的結(jié)合主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，并且受Activin刺激后，影響核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NANOG表達(dá)。

2.Activin/Nodal影響SMAD2/3下游轉(zhuǎn)錄因子甲基化
作者以Activin/Nodal敲降組胚胎干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，未敲降組為對(duì)照，每組三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行m6A RNA甲基化測(cè)序(云序生物提供此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)）。結(jié)果顯示，motif區(qū)域保守序列為GGAC，且大多在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)富集，Activin/Nodal特有甲基化位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低富集。可視化結(jié)果顯示，NANOG和LEFTY1的mRNA分子上存在m6A甲基化信號(hào)（如紅框所示）,并且通過(guò)SMAD2/3的ChIP測(cè)序（云序生物提供此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)）結(jié)果，有一部分區(qū)域與甲基化信號(hào)重疊（如綠框所示）。WTAP或SMAD2/3蛋白R(shí)IP實(shí)驗(yàn)（云序生物提供此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)）證實(shí)，在受Actin分子刺激下，WTAP與NANOG，LEFT，F(xiàn)ZD8和NOC2L結(jié)合增強(qiáng)，而在SMAD2/3分子刺激下，能夠促進(jìn)其降解。

3.Activin/Nodal促進(jìn)SMAD2/3結(jié)合蛋白與下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
前人研究證實(shí)m6A多在細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)pre-RNA的合成，由于本實(shí)驗(yàn)的SMAD2/3通過(guò)與m6A 甲基化酶復(fù)合物結(jié)合，影響靶基因合成的位置同樣也在核內(nèi)，并且SMAD2/3的轉(zhuǎn)錄和甲基化受Activin/Nodal調(diào)控，因此，作者猜測(cè)SMAD2/3可能參與pre-mRNA的合成。通過(guò)抑制Activin/Nodal后檢測(cè)m6A RNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)差異甲基化的情況不單單在外顯子上下調(diào)，同時(shí)在外顯子和內(nèi)含子交界處受抑制。綜上，Actin通過(guò)促進(jìn)磷酸化的SMAD2/3蛋白與下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因發(fā)生m6A RNA甲基化。

4.轉(zhuǎn)錄因子mRNA甲基化負(fù)調(diào)控干細(xì)胞增殖
通常來(lái)說(shuō)，RNA甲基化與基因的表達(dá)關(guān)系密切。作者接下來(lái)分析了甲基化與轉(zhuǎn)錄水平的兩組學(xué)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Activin/Nodal通路后，NNANOG上的m6A甲基化水平與表達(dá)量成反比，并對(duì)神經(jīng)內(nèi)胚層分化起促進(jìn)作用。

總結(jié)
本篇文章首次研究了SMAD2/3蛋白與TGF-β通路間復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過(guò)程。本文結(jié)果展示了SMAD2/3在mRNA上發(fā)揮了調(diào)控，凋亡，DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的生物學(xué)功能，并闡述了此過(guò)程受Activin/Nodal的m6A甲基化調(diào)控，并與甲基化轉(zhuǎn)移酶間的關(guān)聯(lián)。本文為以后研究RNA甲基化非經(jīng)典機(jī)制，如與染色質(zhì)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和表位調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

全文鏈接
https://www.nature.com/articles/nature25784

參考文獻(xiàn)
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2.Wen J, Lv R, Ma H, et al. Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m6A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal.[J]. Molecular Cell, 2018, 69(6):1028. ?影響因子: 14.248
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