Nat. commun | Mettl3介導(dǎo)的m6A RNA甲基化調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞和骨質(zhì)疏松癥的命運

文章導(dǎo)讀：
近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院的周學(xué)東和袁泉研究組，聯(lián)合中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院的林水賓團隊合作研究共同揭示了Mettl3介導(dǎo)m6A RNA甲基化調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞和骨質(zhì)疏松癥命運的新機制。該研究成果以Mettl3-mediated m6A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis為題，于11月14日在《Nature communications》(IF:12.353)雜志在線發(fā)表。
 

 

研究思路
研究團隊首先利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了MSCs有條件的敲除和敲入Mettl3的模型小鼠，然后微型CT和染色顯示敲除后導(dǎo)致低骨量和高骨髓脂肪，并且MSCs中m6A整體甲基化水平也有所降低；同時，與執(zhí)行了卵巢切除術(shù)的模型鼠相比，Mettl3過表達可預(yù)防雌激素不足引起的骨質(zhì)疏松；接下來通過m6A MeRIP-seq和RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)Mettl3缺失的MSCs存在PTH調(diào)控基因表達的全局下調(diào)，提示PTH/Pth1r信號軸可能是Mettl3介導(dǎo)的m6A甲基化對MSCs命運的影響通路。PTH間歇性注射實驗也是印證了m6A通過調(diào)節(jié)PTH/Pth1r信號軸影響MSCs的成骨和脂肪分化的結(jié)論。另外，Pth1r的過表達可以在很大程度上逆轉(zhuǎn)MSCs向脂肪細胞的傾斜分化，改善成骨，進一步證實了PTH/Pth1r信號通路是mettl3介導(dǎo)的m6A修飾控制MSCs譜系分配的新機制。

研究內(nèi)容
1. MSCs 中Mettl3的敲除可導(dǎo)致低骨量、高骨髓脂肪
利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了MSCs有條件的敲除Mettl3的模型小鼠，股骨石蠟切片免疫染色和WB驗證了Mettl3的敲除是的成功的。結(jié)果顯示Mettl3敲除小鼠與對照組相比，骨質(zhì)量損失且骨髓脂肪組織積聚顯著，其骨骼特征與骨質(zhì)疏松癥的病理表型相似。同時LC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)MSCs中m6A甲基化整體水平下降。
 

 
 

2. MSCs中Mettl3的缺失導(dǎo)致成骨潛能降低和脂肪分化增加
接下來，從Mettl3敲除的小鼠中分離出MSCs以驗證其體外成骨和成脂潛能。堿性磷酸酶染色活性減弱，鈣化減少，并且成骨標志物Runx2, Sp7, Alp和 Bglap 表達下調(diào)，表明缺失的MSCs成骨能力不強。相反，油紅O染色強度的增加和顯著的高表達是脂肪形成的潛在因素，包括Pparγ, Cebpα, Adipoq, Plin1和 CD36。

3. Mettl3過表達可預(yù)防雌激素不足引起的骨質(zhì)疏松
為了印證Mettl3過表達是否能夠增強骨骼健康或預(yù)防骨骼疾病，在這里構(gòu)建了MSCs中有條件的敲入Mettl3，使其在MSCs中過表達。通過卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松癥實驗?zāi)Ｐ停�與對照相比Mettl3過表達增加了卵巢切除術(shù)后小鼠成骨細胞數(shù)量，但不影響破骨細胞活性。H&E染色和組織形態(tài)學(xué)分析顯示，去卵巢的對照組小鼠骨髓脂肪細胞過度積累，而去卵巢的Mettl3敲入小鼠骨髓脂肪細胞的增加較小。

 

4. m6A調(diào)控甲狀旁腺激素受體-1（Pth1r）的翻譯
通過m6A MeRIP-seq技術(shù)對MSCs中m6A具體情況進行分析，結(jié)果顯示m6A峰主要位于CDS和3’UTR區(qū)，并且主要位于終止密碼子附近。還發(fā)現(xiàn)Pth1r是MSCs和成骨細胞前體中譜系分配的關(guān)鍵調(diào)控因子，在其翻譯終止密碼子附近具有高富集和特異性的m6A峰。RNA-seq發(fā)現(xiàn)Mettl3缺失的MSCs存在甲狀旁腺激素（PTH）調(diào)控基因表達的全局下調(diào)，提示PTH/Pth1r信號軸可能是Mettl3介導(dǎo)的m6A甲基化對MSCs命運的影響通路。

 

5. m6A對于PTH功能是必不可少的
Mettl3敲除的小鼠經(jīng)PTH處理后骨重塑未見明顯增強，證實敲除Mettl3可減弱PTH誘導(dǎo)的成骨作用。PTH除了在成骨過程中顯著富集外，還能抑制脂肪細胞分化，促進骨形成。PTH間歇性注射顯著降低了Mettl3敲除小鼠體內(nèi)MAT的積累，但很難逆轉(zhuǎn)Mettl3缺失小鼠中較高的骨髓脂肪含量；Pth1r過表達改善了m6A還原引起的油紅O染色強度增加，顯著提高ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成。Pth1r的過表達可以在很大程度上逆轉(zhuǎn)MSCs向脂肪細胞的傾斜分化，改善成骨，進一步證實了PTH/Pth1r信號通路是mettl3介導(dǎo)的m6A修飾控制MSCs譜系分配的新機制。

 

總結(jié)
Mettl3介導(dǎo)的真核生物m6A RNA甲基化修飾對穩(wěn)定體內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有廣泛的功能影響，而m6A水平的任何擾動都可能導(dǎo)致功能障礙或疾病。在這里研究證實了骨髓間充質(zhì)干細胞中Mettl3的缺失破壞了小鼠的細胞命運，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥病理表型如成骨潛能不全的骨量減少、成骨潛能增強的骨髓脂肪增多等，揭示了m6A對骨髓間充質(zhì)干細胞的有效特異性調(diào)控。此外，Mettl3功能的增加可以預(yù)防雌激素不足引起的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，確立了Mettl3在確定骨髓MSC命運中不可或缺的作用，從而保證骨骼健康。早期骨髓間充質(zhì)干細胞中m6A表觀遺傳修飾的減少抑制哺乳動物Pth1r的翻譯，并在骨積累過程中阻斷其對PTH的合成反應(yīng)。這些功能缺陷使MSC微妙的分化平衡向脂肪譜系傾斜，導(dǎo)致嚴重的骨質(zhì)流失和過度的MAT堆積。實驗數(shù)據(jù)豐富了m6A調(diào)控干細胞分化的證據(jù)，揭示了調(diào)控不當(dāng)?shù)膍6A修飾與骨病理障礙之間的功能聯(lián)系，從而為骨質(zhì)疏松癥治療新策略的開發(fā)提供了可能。
全文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41467-018-06898-4
 
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