單細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)移的新用法——單個細(xì)胞級別的分離和轉(zhuǎn)移
2014年10月30日發(fā)表于Lab on a Chip雜志。
單細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)移的最新用法——單個細(xì)胞級別的分離和轉(zhuǎn)移
在當(dāng)代生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的研究中，對單個細(xì)胞的分離一直有著很高的需求。然而傳統(tǒng)手段往往需要將大量細(xì)胞懸浮后進行分選接種。這類方法不僅費時費力，而且細(xì)胞活力也會受到影響。本篇報道中Guillaume使用FluidFM BOT建立了一種非常簡易、快速的新手段。
單細(xì)胞分離有哪些優(yōu)勢？
由于蛋白和基因的隨機表達(dá)性，即使同一基因源的細(xì)胞也可能會有所不同。因此單細(xì)胞分離對于克服細(xì)胞異質(zhì)性有著十分重要的意義。能夠讓研究者從一群混合細(xì)胞群中挑選特定感興趣的細(xì)胞，之后既可以用于單細(xì)胞分析，也可以用于單克隆擴增。這種檢測手段能夠檢測到常規(guī)細(xì)胞檢測手段所不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞群中的多樣性。
另外對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染、感染、注射的實驗來說，選取單個細(xì)胞對于建立特定基因或表達(dá)特定蛋白的克隆來說更是十分必要的。因為只有單一基因的細(xì)胞群才能最大限度的保持種群穩(wěn)定。
在目前的研究中，分離單細(xì)胞的手段主要是通過將細(xì)胞懸浮后做高通量篩選。其中主要使用的是流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）或者免疫磁性細(xì)胞分選法（MACS）。這兩種方法在臨床上目前均廣泛應(yīng)于細(xì)胞篩選。然而這兩種方法均需要使用相當(dāng)大量數(shù)量的細(xì)胞，一般在105-106數(shù)量級上。然而很多研究中，培養(yǎng)出的細(xì)胞不太容易達(dá)到這個數(shù)量級。而在少量細(xì)胞分選中，這兩種方法均面臨著極大地挑戰(zhàn)。
微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)讓少量細(xì)胞分選有了新的選擇，該方法主要通過熒光、磁力、流體動力流、聲光電泳、介電泳粘附等性質(zhì)進行分離。這種方法往往需要較低的細(xì)胞濃度來實現(xiàn)單細(xì)胞分離，因此在分離過程中需要嚴(yán)格控制進入微流控芯片中的細(xì)胞量。
上述的分離方法有著廣泛的應(yīng)用，但是其應(yīng)用卻也受到其本身性質(zhì)的應(yīng)用。因為無論是哪種方法都僅限于操縱懸浮溶液中的細(xì)胞。而對于本身還處在貼壁狀態(tài)的細(xì)胞卻需要將其完全解離后才能處理。對于目前的研究，絕大部分的哺乳類細(xì)胞任然需要貼壁培養(yǎng)。但是卻鮮有成熟的方法能夠用于這種分離方式。
FluidFM分離方法
流體力學(xué)顯微鏡（FluidFM）是將微量注射與原子力顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的最新型顯微鏡。它能夠在細(xì)胞表面實現(xiàn)精準(zhǔn)的移動和fL級的流體移動控制。因此在技術(shù)層面上擁有非常優(yōu)越的單細(xì)胞操縱能力。
因此Guillaume等首先對FluidFM對單細(xì)胞噴灑胰酶的消化能力進行了考察。他們將胰酶噴灑在細(xì)胞上方，再觀測細(xì)胞消化程度隨時間的變化。通過他們的研究，他們研究了壓力與淋撒體積之間的關(guān)系、胰酶作用時間與消化范圍之間的關(guān)系、胰酶淋撒壓力與消化面積之間的關(guān)系如圖1所示。
圖1，胰酶釋放控制對細(xì)胞消化的影響。A）胰酶釋放兩樣與壓力脈沖參數(shù)之間的關(guān)系；B）胰酶作用時間與消化細(xì)胞面積之間的關(guān)系（200mbar，10s）；C）細(xì)胞消化面積與時間之間的關(guān)系（200mbar，10s）；D）最終消化面積與施加壓力的對應(yīng)關(guān)系。
之后他們嘗試對單個Hela細(xì)胞進行了消化，通過對壓力和作用時間的控制，可做到僅將目標(biāo)細(xì)胞分離但不對周圍任何細(xì)胞產(chǎn)生影響，如圖2所示。
圖2 單個細(xì)胞可控消化 A）將HeLa種在載玻片并對其中一個細(xì)胞進行了mRFP-actin轉(zhuǎn)染，在RFP下顯示紅色熒光。B）在細(xì)胞表面噴灑胰酶消化；C）觀測到細(xì)胞成功消化。
隨后他們對含有mRFP-actin的Hela從大量Hela細(xì)胞中進行了分離，并取得了成功，如圖3A。為了一進步驗證這種方法的可靠性，他們再次對這個細(xì)胞新型一次消化并轉(zhuǎn)移，細(xì)胞仍然存活，如圖3B所示。之后他們用這種方法對普通HeLa細(xì)胞進行了分離，并且觀察了它們的存活狀態(tài)如圖3C-E所示，測定存活率可高達(dá)97%。
圖3 單細(xì)胞分離 A）對含有mRFP-actin的細(xì)胞從HeLa細(xì)胞群分離；B）對單個mRFP-actin HeLa細(xì)胞進行分離；C-E）對分離后的HeLa細(xì)胞進行了FDA/PI染色。并種在三種不同的微孔板中。（紅色為死亡細(xì)胞，綠色為存活細(xì)胞）。
使用FluidFM分選細(xì)胞
而對于懸浮細(xì)胞的分選工作，F(xiàn)luidFM也能夠輕松應(yīng)對。首先Guillaume對單個細(xì)胞進行了轉(zhuǎn)移實驗。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)以ΔP = -100 mbar條件對細(xì)胞進行吸取，即可將細(xì)胞吸入移液槍中。隨后將探針轉(zhuǎn)移至新的微孔中再以ΔP = +1000 mbar作用1-2s即可將細(xì)胞吐出。在之后的培養(yǎng)中也可觀測到細(xì)胞貼壁生長，說明這種分選對細(xì)胞沒有損傷，如圖4A所示。
而后他們對細(xì)胞進行了連續(xù)分選，將形態(tài)相似的細(xì)胞放入同一小室，如圖4B所示。以及根據(jù)熒光標(biāo)記不同分別放入不同小室，如圖4C所示。使用這種方法分選一樣簡單可靠。
圖4細(xì)胞分選 A）對活細(xì)胞進行分選并記錄圖像。在分選后1小時，細(xì)胞開始貼壁生長；B）連續(xù)對細(xì)胞進行分選，并放置到同一個小孔中。C）根據(jù)染色標(biāo)記將不同染色的細(xì)胞分類放置在不同小室中。
總結(jié)
FluidFM是一種強大的分離單細(xì)胞的強大手段，通過使用光學(xué)手段甄選出感興趣的細(xì)胞后，就能夠使用FluidFM技術(shù)對其分離，并且不會對細(xì)胞造成損傷，能夠保證所分離的細(xì)胞最大限度的存活。這種方法的應(yīng)用將會給生物和醫(yī)學(xué)研究提供極大地幫助，尤其對于單克隆細(xì)胞群的建立或單細(xì)胞的下游分析。
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)——瑞士 Cytosurge FluidFM BOT
產(chǎn)品簡介：
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)--FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。
FluidFM BOT極大的方便了單細(xì)胞水平的研究，尤其適合應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療、單細(xì)胞生物學(xué)、單細(xì)胞質(zhì)譜、單細(xì)胞基因編輯、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)--FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。
FluidFM BOT極大的方便了單細(xì)胞水平的研究，尤其適合應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療、單細(xì)胞生物學(xué)、單細(xì)胞質(zhì)譜、單細(xì)胞基因編輯、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
注射、提取、分選一體化的單細(xì)胞操縱解決方案
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相關(guān)產(chǎn)品及鏈接：
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