細胞內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
 
主要用途
 
細胞內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑是一種旨在通過內(nèi)質網(wǎng)鈣離子特異性熒光探針Mag-Fluo-AM，與鈣離子結合后，其熒光強度顯著增強，在熒光酶標儀下觀察相對熒光峰值的變化，來測定內(nèi)質網(wǎng)中總鈣離子濃度的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞（動物、人體等）內(nèi)內(nèi)質網(wǎng)鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。
 
技術背景
 
鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結合鈣，其構成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。在細胞內(nèi)，鈣離子主要儲存在線粒體和內(nèi)質網(wǎng)等細胞器中。其中內(nèi)質網(wǎng)鈣離子儲存在控制細胞活化、調控信號通路、蛋白分子轉錄后修飾，維持細胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。內(nèi)質網(wǎng)鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要內(nèi)質網(wǎng)純化。Mag-Fluo-AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標記染料，特異性地由內(nèi)質網(wǎng)捕獲，可以檢測內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)的游離鈣離子濃度的變化。在熒光酶標儀下，激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm，來定量測定內(nèi)質網(wǎng)的鈣濃度。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
清理液（Reagent A）      40毫升
染色液（Reagent B） 30微升
介導液（Reagent C）     600微升
通透液（Reagent D）     120微升
飽和液（Reagent E）       2毫升
陰性液（Reagent F）       2毫升
產(chǎn)品說明書     1份
 
保存方式
 
保存清理液（Reagent A）、染色液（Reagent B）、介導液（Reagent C）和通透液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器
細胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育
黑色96孔板：用于樣品操作的容器
熒光酶標儀：用于熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察
 
實驗步驟
 

• 測定準備

 

• 設定好熒光酶標儀（22℃）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

 
二、熒光酶標儀檢測
 

• 準備1個黑色96孔板，標記為：細胞樣品孔、空白對照孔（不含細胞）、最大對照孔（含細胞）
• 小心抽去細胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 小心加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 小心抽去清理液
• 小心加入100微升 清理液（Reagent A）
• 小心加入10微升染色工作液
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 加入200微升清理液（Reagent A） 
• 加入2微升通透液（Reagent D）
• 放進37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定最大內(nèi)質網(wǎng)鈣池濃度讀數(shù)）
• 小心抽去含有通透液（Reagent D）的清理液；同時抽去最大對照孔（含細胞）的培養(yǎng)液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 加入100微升飽和液（Reagent E）到最大對照孔里
• 加入100微升陰性液（Reagent F）到空白對照孔里
• 分別加入10微升染色工作液到最大對照孔和空白對照孔里
• 輕輕搖動黑色96孔板，混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計算樣品內(nèi)質網(wǎng)鈣離子濃度

 
【（樣品RFU－空白對照孔RFU）÷（最大對照孔RFU－樣品RFU）】X 22（微摩爾；解離常數(shù)）
 
三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測
 
1． 準備1個待測的細胞爬片樣品

• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述染色工作液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去染色液
• 小心加上200微升清理液（Reagent A） 
• 小心加上2微升通透液（Reagent D）
• 放進37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘
• 小心移去通透液
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上100微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm（內(nèi)質網(wǎng)鈣離子呈現(xiàn)綠色）

 
注意事項
 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 如果熒光淬滅敏感，建議使用抗淬滅劑I-YJ12058.2）
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品