基因改造（包括敲除和敲進(jìn)）小鼠已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在生命科學(xué)、人類醫(yī)藥和健康研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用。今天呢，就給大家介紹最傳統(tǒng)最穩(wěn)定的基因改造技術(shù)：基于胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)。

Capecchi和Smithies早在在1989年根據(jù)同源重組（homologous recombination）的原理，首次實(shí)現(xiàn)了ES的外源基因的定點(diǎn)整合（targeted integration），即基因打靶（gene targeting），如果用外源抗性基因?qū)⒒�因上的一段重要序列替換掉，就成功將目的基因?qū)崿F(xiàn)了基因敲除（gene knockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

 

圖片來(lái)源^[1]

 

是不是感覺很高級(jí)？那么，問題來(lái)了：到底什么是同源重組呢？

 

首先，我們先了解一下什么是同源重組技術(shù)：

 

同源重組（homologous recombination）：是指發(fā)生在姐妹染色單體（sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。在基因改造小鼠制作過程中，需要針對(duì)目的基因兩端特異性片段設(shè)計(jì)帶有相同片段的重組載體，將重組載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞后外源的重組載體與胚胎干細(xì)胞中相同的片段會(huì)發(fā)生同源重組，簡(jiǎn)言之，就是把想改造的部分各制備一段一模一樣的DNA序列（同源臂），然后同源臂之內(nèi)的部分就會(huì)被替換掉了，如圖1所示：

 

 

圖1. 基因敲除鼠制作同源重組原理示意圖^[2]

 

了解同源重組技術(shù)的原理，那基于該原理，如何制備出基因改造小鼠呢？接下來(lái)我們以基因敲除為例，為大家詳細(xì)介紹一下基因敲除小鼠的制備流程：

 

圖2. 基因敲除小鼠制備過程示意圖^[3]

 

01 打靶載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建

 

    首先，第一步，要進(jìn)行打靶載體的設(shè)計(jì)及構(gòu)建。是將目的基因、與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 片段，都重組到帶有標(biāo)記基因(如neoR 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。簡(jiǎn)言之，就是把一個(gè)抗性基因插入到同源臂的兩端，利用“同源重組”把同源臂中的抗性基因替換到基因組對(duì)應(yīng)同源臂中去。

同源臂內(nèi)的抗性基因（我們一般用新霉素抗性基因，即有G418抗性，又名NeoR），我們一般叫“正篩選標(biāo)記”，打靶載體同源臂外部分我們也會(huì)加入一個(gè)致死基因，叫“負(fù)篩選標(biāo)記”。這兩個(gè)篩選標(biāo)記是干什么用的呢？這里我們先賣個(gè)關(guān)子，稍后再做詳解~

 

圖3. 原理圖^[4]

 

02 電轉(zhuǎn)導(dǎo)入打靶載體

 

打靶載體制備完成后，將重組載體通過電轉(zhuǎn)的方法，導(dǎo)入同源的小鼠胚胎干細(xì)胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，用G418篩選轉(zhuǎn)染后的胚胎干細(xì)胞，得到陽(yáng)性克隆 。 

 

03 ES細(xì)胞篩選

 

由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率為10^-2～10^-5，植物的概率為10^-4～10^-5。

那么，既然同源重組率這么低，如何確保篩到正確重組的陽(yáng)性克隆呢？

還記得我們上文提到的打靶載體上的“正篩選標(biāo)記”和“負(fù)篩選標(biāo)記”吧？替換目的基因（或重要區(qū)域）的同時(shí)，插入一個(gè)抗性基因，即“正篩選標(biāo)記”，可以確保得到ES細(xì)胞克隆中已經(jīng)進(jìn)行了重組；在打靶載體上同源臂外插入一個(gè)致死基因，即“負(fù)篩選標(biāo)記”，可以防止打靶載體隨機(jī)插入造成的假陽(yáng)性。正負(fù)篩選標(biāo)記綜合起來(lái)，基本上可以確保拿到的ES克隆是打靶載體兩端通過同源重組插入的了，是不是很聰明呢？

當(dāng)然即使通過正負(fù)篩選標(biāo)記，得到的陽(yáng)性克隆仍然有可能跟理想的插入有個(gè)別堿基或片段的出入，因此就需要進(jìn)一步通過基因組PCR并測(cè)序和southern blot雜交技術(shù)（基因敲除小鼠檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)）對(duì)上一步得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選，最終得到穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆，然后，將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并液氮保存。

 

圖4. 挑選出正確重組的ES細(xì)胞克隆是獲得正確陽(yáng)性小鼠的關(guān)鍵步驟^[5]

 

04 ES細(xì)胞囊胚注射得到嵌合體小鼠

 

經(jīng)歷千辛萬(wàn)苦以后，我們終于得到了正確重組的ES細(xì)胞陽(yáng)性克�。�

下面就是要將ES陽(yáng)性克隆以囊胚顯微注射的方式將注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到代孕的小鼠子宮中。等待后代小鼠出生后，我們就可以通過觀察小鼠的毛色比例（通常我們選用的ES細(xì)胞是黑色C57BL/6小鼠背景，而囊胚供體是白色balb/c背景），來(lái)判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。

 

05 得到嵌合鼠，并獲得F1陽(yáng)性雜合子小鼠

 

將嵌合體小鼠與適當(dāng)品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通過PCR方式來(lái)檢測(cè)小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠就是具備生殖遺傳能力的F1代鼠了哦！

經(jīng)過這一番介紹，大家對(duì)基于胚胎干細(xì)胞的同源重組技術(shù)是不是有了初步了解了呢？

百奧賽圖是國(guó)內(nèi)最早使用近交系C57BL/6胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，并且承諾實(shí)驗(yàn)失敗全額退款的公司，我們自信，在基因改造小鼠方面，我們很專業(yè)！

想要了解更多細(xì)節(jié)，或者想要定制您自己的小鼠？歡迎隨時(shí)跟我們聯(lián)系！

 

參考資料：

[1]https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/summary/

[2] Jun.,2006 Vol.14 No.2中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)

[3] https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/press-release/

[4] Jun., 2006 Vol.14 No.2中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)

[5] http://orthodoxnet.com/blog/2011/06/to-be-or-not-to-be-created/

 

百奧賽圖

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