前言

傳統(tǒng)的 ELISA ( 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ) 方法使用辣根過氧化物酶 (HRP) 底物3, 3’ , 5, 5’ -四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 通常無法檢測(cè)低豐度分析物，例如炎性細(xì)胞因子。SwordDiagnostics公司開發(fā)出新一代ELISA檢測(cè)技術(shù)-Sword ELISA Booster，可直接替代作為金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng) ELISA 檢測(cè)試劑，將靈敏度提升 30 倍。

Sword ELISA Booster 通過加入專有的檢測(cè)試劑來進(jìn)行免疫化學(xué)測(cè)定。Sword 分子在辣根過氧化物酶 (HRP) 存在下轉(zhuǎn)化為共振拉曼活性底物，共振拉曼信號(hào)則在微孔讀板機(jī)上檢測(cè)。由于在低濃度下有著極高水平的酶/底物相互作用，產(chǎn)生出更多的共振拉曼活性分子，從而增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的性能表現(xiàn)。與傳統(tǒng) ELISA 檢測(cè)試劑相比，這一實(shí)驗(yàn)具有更高靈敏度、更低 CV 值和更少噪音。

這里，我們使用 Sword ELISA Boosters 實(shí)驗(yàn)在 Molecular Devices 公司 SpectraMax®iD3、i3x 和 M5 多功能微孔讀板機(jī)的熒光模式下檢測(cè)炎性細(xì)胞因子 TNF-α 和 IL-1β。在上述三臺(tái)讀板機(jī)上分別檢測(cè)濃度低至pg/mL 的這兩種待測(cè)物。

優(yōu)點(diǎn)

- 低豐度分析物的高靈敏度檢測(cè)
- 專有的 Sword 分子對(duì)傳統(tǒng) ELISA試劑的增強(qiáng)
- 低背景噪音和 CV 值

材料

- 用于人 IL-1β 檢測(cè)的 Sword ELISA Booster (Sword Diagnostics cat.#SB-HIL1B02-05)
- 人 IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA (R&DSystems cat. #DY201)
- 用于人 TNF-α 檢測(cè)的 Sword ELISA Booster (Sword Diagnostics cat.#SB-HTNFA02-05)
- 人TNF-α DuoSet ELISA (R&D Systemscat. #DY210)
- 包被有 Nunc MaxiSorp 的免疫清潔標(biāo)準(zhǔn)模塊 ( 條形孔板 ) (Thermo Scientific cat.#445101)
- SpectraMax iD3 多功能微孔讀板機(jī)
- SpectraMax i3x 多功能微孔讀板機(jī)
- SpectraMax M5 多功能微孔讀板機(jī)
- MultiWash+ 洗板機(jī)

方法

準(zhǔn)備工作液和孔板，兩款試劑盒實(shí)驗(yàn)過程參照以下描述。更多關(guān)于試劑操作和方法的細(xì)節(jié)請(qǐng)參考產(chǎn)品手冊(cè)。

Sword ELISA Booster底物溶液

為準(zhǔn)備 16 mL 足夠用于 96 孔板的Sword ELISA Booster 底物溶液，以下試劑需再加入 11.2 mL 去離子水：
- 1.6 mL Sword Booster Component A (10x)
- 1.6 mL Sword Booster Component B (10x)
- 1.6 mL Sword Booster Component C (10x)

1x Sword Development 溶液

為準(zhǔn)備 16 mL 足夠用于 96 孔板的Sword Development 溶液，3.2 mL 5x Sword Development 溶液 (Component D) 加入 12.8 mL 去離子水。

準(zhǔn)備孔板

IL-1β 和 TNF-α 捕獲抗體分別重溶于0.5 mL PBS 中制成抗體濃縮液。濃縮的人 TNF-α 捕獲抗體在 PBS 中稀釋至12 μg/mL，人 IL-1β 捕獲抗體稀釋至 4μg/mL，制成工作濃度。每塊實(shí)驗(yàn)孔板分別包被 100 μL/孔的稀釋后抗體。然后將孔板密封并在 4°C 下孵育過夜。

使用 MultiWash+ 微孔洗板機(jī)，以 400μL/孔清洗緩沖液 (PBS + 0.5% Tween20) 清洗孔板 3 次，每次吸液前先讓清洗緩沖液在孔中停留 15-30 秒。然后每塊孔板以 200 μL/孔用于 IL-1β 或TNF-α 的 Sword ELISA Blocker 進(jìn)行封閉，密封并在室溫下至少孵育 1 小時(shí)。再次如上所述清洗孔板。

測(cè)定流程

結(jié)果

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