自從 Sanger等(1975)引人雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)作為鏈終止劑,DNA序列測定技術得到迅速發(fā)展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通過其5三磷酸基團可以摻入到正在延伸的DNA鏈中,但由于其脫氧核糖3位置缺少一個羥基,因此不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵,使得DNA鏈的延伸被終止。根據(jù)此原理,在DNA合成反應混合物的4種dNTP中加入一定比例的一種 ddNTP,dNTP參與的鏈延伸將與ddTP參與的鏈終止發(fā)生隨機競爭,最終反應產物是一系列的寡核苷酸鏈,其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨立的酶反應中分別采用4種不同的dNTP,結果將產生4組寡核苷酸鏈,它們將分別終止于模板鏈的每個A、C、G或T的位置上,通過電泳分離和放射自顯影,就可以進行序列判讀。

 

PCR測序根據(jù)標記的方式不同和循環(huán)的次數(shù)不同可分為直接測序法和循環(huán)測序法。

 

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 直接測序法 

 

一、原理

PCR擴增獲得雙鏈DNA產物經變性形成單鏈,測序引物與其中一條模板鏈上的互補序列退火。退火的引物在低進行性反應條件下(如低溫和低dNTP濃度),通過DNA聚合酶催化作用延伸20~80個核苷酸;由于此反應體系中摻入放射性標記的dNTP,能使新合成的DNA鏈中含有多個放射性標記,便于產生高放射顯影度。標記的DNA鏈在高進行性反應條件下,通過DNA聚合酶催化進行延伸,通過在反應體系中摻入 ddNTP,使鏈延伸反應終止。反應產物經過電泳分離和放射自顯影,就可以進行序列判讀。

 

二、材料

(1)DNA模板PCR產物離子交換色譜純化,作為DNA模板,濃度為:0.01~0.1mmol/L。

 

(2)引物20個核苷酸的DNA引物可以不經過純化,直接用作測序引物,引物濃度 l mmol/L

 

(3)DNA聚合酶要求該酶在低溫條件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA鏈中摻入放射性標記。比如USB/ Amersham公司生產的測序酶2.0。

 

(4)測序反應緩沖液根據(jù)測序酶具體而定,如測序酶2.0的反應緩沖液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.

 

(5)放射性標記的dNTP一般為[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

 

三、方法

(1)制備鏈延伸終止反應混合物分別在4個微量離心管中各加入一種 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP濃度分別為80m0/L和8pmol/L,37℃預熱5mine

 

(2)制備退火混合物在一個微量離心管中加入PCR擴增DNA1pmol,測序引物1012p5×測序反應緩沖液,用水調整至總反應體積10pl

在加熱儀內94~96℃加熱8min后,迅速放入冰浴中冷卻lmin(適合于雙鏈DNA模板),或者在加熱儀內65℃加熱6min后在加熱儀內自然冷卻到30℃(適合于單鏈DNA模板)。

1000r/min離心10s后在冰浴中冷卻,并迅速進行下一步操作。

 

(3)標記反應在退火混合物中加入2l預冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,現(xiàn)稀釋的測序酶2U,并用水將反應體系調整到15.5,混勻后在冰上孵育2min,放射性標記新合成的DNA鏈。

 

(4)鏈延伸終止反應將3.5標記混合物分別加入4管鏈延伸終止反應混合物中,37℃進行鏈延伸終止反應5min。

 

(5)終止反應體系在各管中加入4終止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),終止反應。樣品可以一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min。

 

(6)電泳分離和放射自顯影每一泳道上樣2~3μl,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

P標記的需要過夜曝光顯影,若用P標記的需要2~3d曝光顯影,讀片。

 

四、注意事項

①標記反應最為關鍵,應在低進行性反應條件下進行。退火后引物只被延伸20~80個核苷酸,并在新合成的DNA鏈中摻入多個放射性標記。對高GC堿基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。

 

②對高GC堿基含量的DNA模板,鏈延伸終止反應混合物中應用7-脫氧2dGTP替代dGTP,以消除電泳過程由于壓縮現(xiàn)象產生的假帶。

 

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 循環(huán)測序法 

 

一、原理

循環(huán)測序法是利用熱循環(huán)儀高效的自動循環(huán)能力,使鏈終止的序列產物以線性方式獲得擴增,從而產生高顯影度的序列梯度。首先將PCR擴增的DNA經變性形成單鏈形式,使標記引物(P、生物素或熒光標記)與其中的一條鏈上的互補序列退火。退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應。由此產生的模板鏈與延伸終止鏈形成的部分雙鏈產物在下一輪測序循環(huán)中,再次被變性,釋放出模板鏈,作為又一輪引發(fā)反應的模板,同時積累下每輪循環(huán)產生的鏈終止產物。這種循環(huán)步驟重復20~40次,使鏈終止產物以線性方式擴增。

與直接測序法相比較,循環(huán)測序法有如下優(yōu)點:所需的模板DNA量少;在高溫下進行,可使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區(qū)域;多輪的變性步驟便于對質粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR產物等雙鏈DNA模板進行測定,不需要經過一個單獨的變性步驟而直接進行測序。

 

二、材料

(1)模板可用PCR擴增好的DNA作模板,也可使用低濃度的dNTP(10~20mol/L)和引物(1mmol/L)來進行靶DNA的PCR擴增,然后直接用PCR產物作為模板。DNA模板濃度:0.01mmol/L

質粒DNA模板用質粒純化試劑盒提取。對于高拷貝數(shù)的質�？梢灾苯訌木�落中獲得測序。測序反應的質粒典型用量:50~200mol

其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制備為常規(guī)分子生物學手段。M3和ADNA作為模板用量:10~100mo黏粒DNA作為模板用量:50~200mol

 

(2)測序引物同位素標記測序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5末端進行同位素標記。引物濃度:0.1~0.2mmol/L

非同位素標記測序引物:用熒光標記4種雙脫氧核苷酸,可以進行以熒光為基礎的雙脫氧測序反應。

 

(3)DNA聚合酶應為無3→5外切活性的耐熱DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。

 

(4)測序反應緩沖液根據(jù)所用的聚合酶具體而定。

 

(5)放射性標記的dNTP根據(jù)所用的聚合酶具體而定

 

三、方法

(本操作方法是以同位素標記為基礎的測序)

 

(1)標記引物取10~15pmol測序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶緩沖液(商品廠家提供),加水至反應體系50,混勻后37℃預熱5min

加人1μ現(xiàn)稀釋的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃繼續(xù)孵育30min。

通過凝膠過濾柱除去未摻入的[yP]ATP

標記好的引物可在-70℃保存2周以上。

 

(2)制備dNTP/ ddNTP混合物在4個微量離心管中各加入一種dNTP/ ddNTP混合物2ul

 

(3)制備反應混合物取相應的DNA模板、標記的測序引物1~2pmol、3pl的10×測序反應緩沖液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至總體積20l,混勻。在該混合物中加入某些試劑,如DMSO、 Triton X-100、吐溫20或NP40等,徹底混合均勻,可以提高序列梯度的質量。

 

(4)循環(huán)反應分別取反應混合物4團l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的熱循環(huán)儀上進行循環(huán)反應。每次循環(huán)包括:94℃變性1min、40~60℃退火30s和72℃鏈延伸終止30s。循環(huán)次數(shù):20~40次。

 

(5)終止反應體系循環(huán)結束后,在各管中加入4pl終止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),混勻。樣品可在一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min

 

(6)電泳分離和序列判讀每一泳道上樣2~3pl,電泳。采用放射自顯影方法進行序列判讀標記的需要過夜曝光顯影,若用P標記的需要2~3d曝光顯影。

 

四、注意事項

①在標記引物過程中,為獲得高比活的標記引物,反應體系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一個最佳水平

 

②確定最佳dNTP/dNTP比例非常關鍵,應采用產生低本底、高顯影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。

 

③為了提高靠近引物(1~100個堿基范圍內)的序列梯度的自顯影強度,可以向測序反應體系中加人Mn2,提高DNA聚合酶對摻入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而當為了提高遠離引物(200~400個堿基范圍內)的序列梯帶的自顯影強度,則需要提高鏈延伸終止反應混合液中dNTP的含量,具體依所用聚合酶而定。

 

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 全自動DNA測序法 

 

隨著科學技術的發(fā)展,DNA測序已從人工操作發(fā)展到用自動測序儀進行全自動測序,使得測序的準確度、樣品序列判讀長度和速度有了極大的提高。如今科研工作者只需準備好所需測序的樣品,送至專業(yè)的測序公司用全自動DNA測序儀(如 Applied biosystems的377型全自動DNA測序儀)進行測序即可。本節(jié)簡單介紹全自動DNA測序儀的特點,不對全自動測序儀的具體操作步驟和注意事項等做詳細介紹。

 

全自動測序儀一般由:電泳系統(tǒng),激光檢測裝置,軟件,計算機和打印機等幾部分組成。

 

全自動測序儀采用4種熒光染料標記核苷酸、在一個泳道測序的方法,有效地避免了因單一標記方法(如同位素標記)中4個泳道電泳時所造成的遷移率不同對測序準確度的影響。

 

由于可以采用兩種熒光標記方法(標記dNTP法和標記引物5端法)、多種DNA聚合酶和測序試劑盒,使得測序DNA模板種類大大增加,如單鏈DNA、雙鏈DNA和PCR產物等。

 

全自動測序儀可以采用激光激發(fā),使得代表不同堿基信息的不同顏色熒光先經過光柵分光,經CCD攝像機同步成像,一次掃描可以檢出多種熒光,使得測序速度高達200bp/h,一個樣品一次可以測定700余個堿基。

 

在電泳技術方面,簡化了灌膠技術,采用精確控溫,提高了測序的精確度

 

應用多種軟件,可以進行DNA片段大小和定量分析、遺傳基因的組型分析、DNA亞克隆序列拼接、DNA和蛋白質序列比較等。

 

全自動測序儀可以使得一次測序樣品數(shù)量大大增加,多達96個樣品,極大地提高了工作效率�，F(xiàn)在國內有許多公司進行全自動測序,只需要將克隆的菌株交給公司,一般在3~5d后即可得到結果,測序的長度在每個反應500~800bp左右。

 

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 應用 

 

PCR測序是對生物遺傳信息的最終判定。隨著各種基因組計劃的開展,PCR測序工作在不斷加強和完善,特別是全自動DNA測序儀的開發(fā),為提前完成人類基因組計劃奠定了基礎。此外,在臨床遺傳病、傳染性疾病和癌癥的基因診斷、農業(yè)畜牧業(yè)的動植物育種、法醫(yī)鑒定等領域上有廣泛的應用前景。過去由于全自動DNA測序的儀器成本較高,手工的同位素標記的測序在國內曾經發(fā)揮過重要作用;但隨著國內科研試驗條件的改變,全自動DNA測序儀已在國內廣泛應用于序列的測定,但全自動DNA測序儀廣泛應用于突變的檢測目前還受國內實驗條件的限制。

 

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