細(xì)胞尿激酶（UROKINASE）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版） 主要用途

 細(xì)胞尿激酶（ UROKINASE ） 活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過三肽化合物底物p-ERG-pNA 受到尿激酶的水解，釋放黃色對(duì)硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體等）尿激酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷， 性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

尿激酶（urokinase；UK；EC3.4.21.73），又稱為尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type PlasminogenActivator；uPA），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細(xì)胞外基質(zhì)和尿液中。尿激酶由411氨基酸構(gòu)成，分子量為54KD，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為 Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細(xì)胞蛋白水解過程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細(xì)胞外基質(zhì)降解等。尿激酶與組織重構(gòu)、修復(fù)、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴(kuò)散有關(guān)。尿激酶的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）�；�于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p-Nithoaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰對(duì)硝基苯胺）受到尿激酶的水解，釋放有色對(duì)硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長(zhǎng)）下，測(cè)定吸光峰值的變化，來(lái)定量測(cè)定尿激酶的活性。尿激酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 陰性液（Reagent D） 毫升

 底物液（Reagent E） 微升

產(chǎn)品說明書 1 份

存方式

保存  清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5 毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于樣品比色測(cè)定的容器酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品制備

1. 準(zhǔn)備好 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 106細(xì)胞）

2. 小心加入xx 毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5. 加入xx 毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6. 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7. 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx 微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11. 強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

12. 置于冰槽里孵育 30 分鐘

13. 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14. 小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

15. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

YIJI30030.1）

16. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品

2. 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為 37℃）：波長(zhǎng) 405nm，并置零三、 活性測(cè)定

1. 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2. 分別移取xx 微升  緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中

3. 分別加入xx 微升  陰性液（Reagent D）或上述制備的待測(cè)樣品（50 微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

4. 分別加入xx 微升  底物液（Reagent E）

5. 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板（注意：避免氣泡）

6. 在 37℃溫度下孵育 60 分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）

7. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到 100 微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)

8. 活性計(jì)算：

（1） 酶標(biāo)儀檢測(cè)

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

（2） 比色皿檢測(cè)

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為 21 次操作，包括背景對(duì)照

2. 操作時(shí)，須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需 1 次

4. 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融

5. 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù) 60 分鐘

6. 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底

7. 樣本測(cè)定 60 分鐘讀數(shù)高于 0 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

8. 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間至 16 小時(shí)； 其次增加樣本量（本公司提供  Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒YIJI30030.1）

9. 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

10. 尿激酶單位活性定義為：在 37℃，pH 7..5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離 1 微摩爾三肽化合物底物

p-ERG-pNA 所需的酶量作為一個(gè)活性單位

11. 本公司提供系列細(xì)胞蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感