一、簡介 

在基于哺乳動物細胞的研究中，酶標儀主要應用于: (1) 常規(guī)分子檢測，如核酸、蛋白濃度及酶活性分析等；(2) 信號轉(zhuǎn)導研究， 如一些細胞信號事件如 ROS，修飾的檢測；(3) 整體細胞水平的分析，如細胞的活力、凋亡和殺傷等。然而在植物領(lǐng)域中，酶標 儀的應用則偏向前兩個方向，此外，植物領(lǐng)域的酶標儀應用普遍度也不及動物，但這并不限制酶標儀在該領(lǐng)域的應用前景。在此， 我們結(jié)合常見的應用案例介紹酶標儀在植物領(lǐng)域中的應用，提升酶標儀在植物研究中的應用價值，并進一步協(xié)助植物的科研發(fā)展。 

二、利用酶標儀進行常見的分子檢測和分析 

在植物領(lǐng)域中一些基礎(chǔ)的分子檢測，如基于紫外吸收或熒光的 DNA，RNA 和蛋白定量及純度分析等，都可以用酶標儀進行 高通量檢測。由于原理和應用類型與研究哺乳動物細胞類似，在此就不贅述了，大家有需求可參考我們針對核酸定量的應用材料。 在此我們主要列植物領(lǐng)域中比較特色的幾個案例。 

2.1 吸收峰和熒光光譜分析 

植物領(lǐng)域中通常會涉及到對一些感興趣的化合物，如色素等的物理指標分析，其中就包括吸收峰分析和針對具有熒光特質(zhì)的 化合物進行熒光光譜分析。通常這些分析會由分光光度計完成，但會受到通量和曲線分析能力的限制�，F(xiàn)階段大部分 Molecular Devices 推出的配備光柵的酶標儀如 M 系列和 iD 系列都支持出色的光譜掃描分析，包括全波長光吸收和熒光光譜掃描，步進可精 確至 1 nm，可應對常見的光譜分析需求，并極大提高通量。同時配備的 SoftMax Pro 軟件可自動分析光譜圖簡化處理流程。

基于光譜掃描還可用于進一步分析具有調(diào)節(jié)熒光能力的蛋白功能，如藍藻細菌中的 Orange Carotenoid Protein (OCP) 在強 藍-綠光下會和藻膽 ( 蛋白 ) 體 (PBS) 相互作用來保護細胞。實驗中可觀察到 OCP 的引入可降低 PBS 的熒光發(fā)射強度。對于新發(fā)現(xiàn) 的 OCP 家族成員，我們就可以通過熒光光譜掃描功能確認其是否會淬滅 PBS 的熒光 ( 圖一 )。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于已知的 OCP1，新 發(fā)現(xiàn)的 OCP2 具有較弱的熒光淬滅能力 ( 圖一，來源于文獻 Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089. )。

^{圖一 分析 OCP 的 PBS 熒光淬滅能力，黑色實線代表無強藍-綠光照射下 PBS 的熒光發(fā)射譜 ( 激發(fā) 580 nm )，黑色虛線代 表在強藍-綠光照射下 PBS 的熒光發(fā)射譜。藍色和紅色虛線分別代表在在強藍-綠光引入 OCP1 和 OCP2 。 圖片來源于文獻：Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089.。酶標儀為 SpectraMax M2。}

2.2 酶活分析

在植物研究中，酶活分析也是常見的檢測之一，主要用于探究植物本身酶的功能和植物提取物對各種酶活性的影響�；�于底 物工作機制的不同，酶活可用光吸收法和熒光法檢測。例如圖二就展示了多種植物的提取物對參與血糖調(diào)控的 α-淀粉酶 (α-amylase) 和 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase) 活力的抑制 ( 來源于文獻：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12;60(36):8924-9.)。其中，α-淀粉酶 的活力檢測是基于使用自身淬滅的 DQ™ starch 熒光底物。隨著底物在酶的作用下發(fā)生降解，進而發(fā)出熒光，并可通過熒光強度 的變化分析酶活。而 α-葡萄糖苷酶活性的檢測則基于其底物光吸收屬性在酶處理下的變化。

^{圖二 不同濃度植物提取物對 α-淀粉酶 ( 左 ) 和 α-葡萄糖苷酶 ( 右 ) 活力的抑制。圖片來源于文獻：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12;60(36):8924-9.。酶標儀為 SpectraMax Gemini ( 熒光檢測 ) 和 SpectraMax 190 ( 光吸收檢測 )}

通常，酶活檢測基于動力學檢測模式，同時需要進行控溫。多數(shù) Molecular Devices 推出的酶標儀均可完成酶活檢測。除此 之外，配備的 SoftMax Pro 軟件支持工作流，可進行復雜的酶活設(shè)定和檢測，同時對動力學的多種分析，如斜率，最高速度，曲 線下面積等，都可輕松用軟件批量分析。

2.3 DPPH 和 ORAC 分析

DPPH 和 ORAC 分析是抗氧化研究中常見的兩個檢測項目，常被用于分析植物和中藥提取物的抗氧化能力。其中 DPPH ( 1,1二苯基-2-三硝基苯肼 )自由基清除實驗基于帶有自由基的 DPPH 和中和后的 DPPH 具有不同的光吸收屬性進行分析待測物質(zhì)是否 具有自由基清除能力 ( 圖三 )。

^{圖三 DPPH 工作原理，圖片來源于網(wǎng)址：https://www.omicsonline.org/articles-images/2161-0444-4-517-g001.html}

因此，配備光吸收功能的酶標儀就可用于檢測 517 nm 附近的吸收強度變化，進而推測待測樣本的自由基清除能力。圖四展 示了不同的類胡蘿卜素的抗氧化能力比較 (Sci Rep. 2016 Feb 23;6:21987.)。

^{圖四 基于 DPPH 自由基清除實驗比較不同類胡蘿卜素的抗氧化能力， 圖片來源于文獻：Sci Rep. 2016 Feb 23;6:21987.。酶標儀為 SpectraMax Plus384。}

ORAC 實驗則是檢測氧化自由基吸收能力 (Oxygen Radical Absorbance Capacity)，與 DPPH 不同，其基于熒光法。體系中 引入的自由基產(chǎn)生者 AAPH (2,2’-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride) 會破壞熒光探針，使熒光強度逐漸衰退。而引 入的具有抗氧化能力的待測樣本則會抑制熒光強度的衰退，進而通過計算熒光動態(tài)曲線的曲線下面積 (AUC) 的變化可分析待測化 合物的抗氧化能力 ( 圖五 )。一般，ORAC 實驗中會用 Trolox 標準品作為校準，獲得不同待測樣本的抗氧化指數(shù) ( 圖五， Molecules. 2013 Oct 17;18(10):12937-50. )。

^{圖五 利用 ORAC 實驗分析不同草藥提取物的抗氧化能力。左圖為熒光動力學曲線，可觀察到草藥提取物的引入增加 了熒光探針的信號壽命 ( 曲線下面積 )。右圖為參考 Trolox 結(jié)果得出抗氧化指數(shù)。圖片來源于文獻：Molecules. 2013 Oct 17;18(10):12937-50.。酶標儀為 SpectraMax Gemini}

三、利用酶標儀進行植物信號分析

除了一些常見分子的分析和定量之外，常見的植物信號，如報告基因、蛋白蛋白相互作用和 ROS 分析等，也都可以用酶標儀 進行高通量的分析。

3.1 報告基因分析

基于 β-葡萄苷酸酶 (β-glucuronidase) 的 GUS報告基因系統(tǒng)利用了在高等植物中 β-glucuronidase 表達和活性很低，是常見 的研究植物基因功能和活力的分析方法。基于不同的底物，GUS 報告基因可用多種方法學進行檢測，包括組織染色法、光吸收法 和熒光法。在此主要介紹可用于熒光酶標儀分析的熒光法，其主要基于底物 MUG (4-methylumbelliferyl b-D-glucuronide)，其 在 GUS 的作用下產(chǎn)生具有熒光的 4-MU (4-methylumbelliferone)，可以進一步用熒光酶標儀進行分析。在進行熒光法 GUS 報告 基因檢測時，通常需要 4-MU 標準品進行校準，同時 GUS 的活性還需要進一步使用總蛋白量來校準。此外，4-MU 本身容易降解， 因此使用時注意保護和有效期。

熒光法 GUS 報告基因系統(tǒng)在植物研究中的應用方向很多，其中包括特定的基因啟動子活力在激素處理和壓力情況下的變化 ( 圖六，J Exp Bot. 2005  Mar;56(413):909-20. ) 和特定基因的過表達是否會影響靶基因啟動子活力 ( 圖七，Mol Plant. 2012 Sep;5 (5):1042-57. ) 等。 

^{圖六 利用 GUS 報告基因檢測不同激素 ( 上圖 ) 和壓力 ( 下圖 )情況下基因啟動子活力的變化。白框表示對照組，灰 線代表處理組。圖片來源于文獻：J Exp Bot. 2005  Mar;56(413):909-20.。酶標儀為 SpectraMax Gemini}

^{圖七 利用 GUS 報告基因檢測 RAP2.11 過表達對 AtHAK5 啟動子活力的影響。 圖片來源于文獻：Mol Plant. 2012 Sep;5(5):1042-57.。酶標儀為 SpectraMax Gemini}

3.2 蛋白蛋白相互作用分析

信號轉(zhuǎn)導研究中蛋白之間的相互作用 (Protein-Protein interaction，PPI) 分析是關(guān)鍵的一環(huán)，植物研究也不例外�，F(xiàn)階段， 研究植物體內(nèi)體外的PPI的方式有很多種，包括免疫共沉淀、FRET等。在這我們主要介紹利用酶標儀的兩個方法：基于熒光的 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 和基于化學發(fā)光的 Split luciferase complementation assay (SLC)。

BIFC 是基于對熒光探針如 GFP、YFP 的 N,C 端拆分并分別和需研究的 PPI 成員克隆在一起。存在相互作用的情況下，探針的 N,C 端接近，具有熒光屬性 ( 圖八 )。此時就可用熒光酶標儀高通量分析是否存在 PPI。BIFC 的優(yōu)勢是檢測體內(nèi)的PPI存在，同時 結(jié)合熒光顯微鏡還可分析PPI發(fā)生的位置 ( 圖九，Plant Cell. 2014 Mar;26(3):1345-59. )。

^{圖八 BIFC 原理，圖片來源于網(wǎng)址：https://commons.wikimedia.org/wiki/file:BiFC_(details).png}

^{圖九 BIFC 應用案例，左圖為熒光顯微鏡分析結(jié)果，右圖為對應的酶標儀檢測結(jié)果 ( 36 份獨立樣本 )， 圖片來源于文獻：Plant Cell. 2014 Mar;26(3):1345-59. 酶標儀為：SpectraMax M5}

SLC 則是基于敏感的化學發(fā)光反應，原理和 BIFC 類似，不過不是拆分熒光探針，而是熒光素酶 ( luciferase，圖十，上 )。 PPI 發(fā)生時，熒光素酶的 N,C 端接近，此時結(jié)合引入的底物就可以進行化學發(fā)光反應，獲得的光信號就可以用酶標儀分析( 圖十，中，下 (Plant J. 2007 Oct;52(1):185-95.；Mol Cell.2018 Feb 1;69(3):493-504.e6. )。由于是化學發(fā)光檢測，SLC 不受植物自發(fā)熒 光的干擾，同時也更為靈敏，缺點是無法直觀檢測 PPI 發(fā)生位置。

^{圖十 上，SLC 原理，中，SLC 檢測流程，下，利用 SLC 檢測候選蛋白之間的相互作用，以及免疫系統(tǒng)的激活對相互 作用的影響。上圖和中圖來源于文獻：Plant J. 2007 Oct;52(1):185-95.。下圖來源于文獻：Mol Cell.2018 Feb 1;69 (3):493-504.e6. 酶標儀為配備化學發(fā)光功能的 SpectraMax 系列}

3.3 ROS 分析

與氧化應激密切相關(guān)的活性氧簇 (Reactive Oxygen Species，ROS) 在植物免疫信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，也是常規(guī)檢 測的信號事件之一。與哺乳動物細胞的 ROS 水平檢測不同，植物 ROS 信號通常用基于化學發(fā)光的魯米諾 (Luminol) 法。Luminol 在氧化環(huán)境下 ( 如結(jié)合 H2O2 )，結(jié)合合適的催化物就會產(chǎn)光 ( 圖十一 )，因此可用于動態(tài)追蹤 ROS 的水平，例如探究不同 表達條件下和突變情況下植物在鞭毛蛋白 flg22 刺激下的 ROS 反應程度 ( 圖十二，Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16(4):48494. ；Mol Cell.2018 Feb 1;69(3):493-504.e6. )。

 

^{圖十一 Luminol 工作原理，圖片來源于網(wǎng)址：https://www.aimsci.com/ros/html/?page_id=285}

^{圖十二 左，利用 Luminol 法檢測 avrB 的表達對 Flg22 刺激的 ROS 水平的影響，圖片來源于：Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16 (4):484-94.，酶標儀為 SpectraMax L。右，研究突變體對 Flg22 刺激的 ROS 水平的影響，圖片來源于：Mol Cell.2018 Feb 1;69 (3):493-504.e6.，酶標儀為具有化學發(fā)光檢測能力的 SpectraMax 系列。}

由于 Luminol 反應為快速化學反應體系，因此需要酶標儀配備注射器系統(tǒng)，如 Molecular Devices 的 SpectraMax L， SpectraMax i3x 等 ( 圖十三 )。除了 luminol 法之外，結(jié)合試劑盒還可通過光吸收法和熒光法進行植物組織的 H2O2 定量 ( 圖十四， Mol Plant. 2013 Mar;6(2):337-49. )。

^{圖十三 Luminol 法結(jié)果示意圖，數(shù)據(jù)基于配備注射器的 SpectraMax L，應用快速動力學模式，采樣間隔 1 秒。 圖片來源于文獻：Mol Plant. 2013 Mar;6(2):337-49.。酶標儀為SpectraMax Gemini。}

^{圖十四 基于熒光法 H₂O₂ 定量，分析基因過表達對 H₂O₂ 的影響。}

 

3.4 基于水母素 (Aequorin) 的鈣信號分析

在哺乳動物和人類細胞中，鈣離子調(diào)控幾乎參與了所有核心的細胞信號事件和行為事件，其和磷酸化調(diào)控被譽為統(tǒng)治級別的 信號轉(zhuǎn)導方式。在植物中也不例外，鈣信號是核心的植物生長和發(fā)育的調(diào)控者，參與了細胞分裂，激素的下游通路和應激反應等 等 (Plant Cell. 2005 Aug;17(8):2142-55.)。在哺乳動物細胞研究中，鈣流通常是基于熒光探針法，然而，在植物中存在多種色素 和自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾，因此相關(guān)研究會主要基于 Aequorin 法，其主要基于使用過表達的 Aequorin 蛋白。通過三個高親和力位 點結(jié)合鈣離子后，在氧的作用下 Aequorin 會不可逆催化 coelenterazine 發(fā)出藍光 ( 圖十五，Methods Mol Biol. 2013;1043:4554. )。該反應屬于化學發(fā)光，可用支持對應檢測模式的酶標儀進行分析。

^{圖十五 利用 Aequorin 檢測鈣流原理圖，圖片來源于文獻：Methods Mol Biol. 2013;1043:45-54.}

由于鈣離子流動是快反應，因此針對的檢測模式為化學發(fā)光快速動力學檢測，因此儀器需有配備有注射器和化學發(fā)光檢測能 力，如Flexstation 3，SpectraMax i3x和SpectraMax L等 (圖十六)。

^{圖十六 上圖，Aequorin 法檢測植物鈣流結(jié)果示意圖，數(shù)據(jù)來源于配備注射器的 SpectraMax i3x。下圖，利 用 Aequorin 法檢測基因突變對 glutamate 刺激的鈣流的影響，突變來源文獻：J Exp Bot. 2016 Mar;67 (6):1853-69.。酶標儀為 Flexstation 3}

與常見的熒光法不同，Aequorin 本質(zhì)為化學發(fā)光法，因此避免了由激發(fā)光帶來的光損傷影響，同時也不受化合物自發(fā)熒光的影 響，具有更低的背景等優(yōu)勢。

四、利用酶標儀進行植物-微生物相互作用分析

在最后一章中，我們會涉及到植物整體水平的分析，主要關(guān)注近幾年興起的植物-微生物相互作用分析。我們會通過兩個案 例向大家介紹酶標儀在這個方向的應用。

第一個案例關(guān)注植物，如擬南芥與在植物根上常見的微生物如熒光假單胞菌之間的共生關(guān)系。為了確認植物來源的變化是否 會影響共生微生物的適應能力，科學家建立基于 24 孔板的高通量篩選系統(tǒng) ( Rhizosphere assay 圖十七，Nat Plants. 2015;1 (6). )。在體系中，通過水培將擬南芥種在 24 孔板中的漂浮網(wǎng)盤上，這樣只有根浸入培養(yǎng)基中。再引入標記了 GFP 的細菌，就可 以使用酶標儀進行高通量的微生物增殖分析了( 圖十七 )。由于體系培養(yǎng)基中無碳，因此微生物的增殖需要依靠植物本身的光合產(chǎn) 物。

 

^{圖十七 上圖，Rhizosphere assay 示意圖。左邊放大圖可觀察擬南芥種于漂浮網(wǎng)盤上，右圖為引入微生物 P. fluorescens 7 天后的照片。 下圖，基于 Rhizosphere assay 篩選 196 株擬南芥的結(jié)果。圖片來源于文獻：Nat Plants. 2015;1(6).。酶標儀為 SpectraMax M3。}

第二個案例同樣基于 GFP 蛋白的熒光檢測，但是基于檢測真菌對植物的侵染機制。一些真菌的效應蛋白，如大豆疫霉菌的 Avr1b 蛋白可直接將 GFP 蛋白轉(zhuǎn)入至植物細胞中，這樣就可以通過酶標儀分析靶細胞的熒光檢測霉菌的感染能力和進一步機制研 究 ( 圖十八，Cell. 2010 Jul 23;142(2):284-95. )。在此，為了獲得更具有代表性的熒光信號，我們可使用 Molecular Devices 具有 孔掃描功能的酶標儀進行多點信號的采集和平均。

^{圖十八 基于熒光法動態(tài)分析 A549 細胞對霉菌效應蛋白的攝入。 圖片來源于文獻：Cell. 2010 Jul 23;142(2):284-95. 。酶標儀為 SpectraMax Gemini。}

五、總結(jié)

上述的案例向我們展示了一些酶標儀在植物領(lǐng)域常見的應用方向。從常規(guī)的分子分析、酶活檢測到植物信號的研究等，都可 以應用酶標儀進檢測和分析，在提高通量的同時簡化實驗的流程。

針對植物領(lǐng)域 Molecular Devices 提供了包括硬件和軟件的解決方案。對于常見的光吸收實驗，如紫外法核酸蛋白定量和光 吸收酶活、ELISA 等，我們推薦配備比色皿端口的全波長光吸收酶標儀 SpectraMax Plus 384，其配備了 8 套檢測光路，適合于 高通量光吸收分析。針對熒光檢測，如報告基因和酶活，推薦靈敏的 SepctraMax Gemini 熒光酶標儀。而針對化學發(fā)光檢測，如 報告基因，ROS 檢測，則推薦具有高達9個動態(tài)檢測數(shù)量級的 SpectraMax L，其能配備注射器體系，適用于各種快/慢反應的檢 測。除了單功能外，我們也有支持多個功能檢測的酶標儀平臺，如經(jīng)典的M系列和新推出的 iD 系列可供選擇。

在軟件上，業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的 SoftMax Pro 軟件可輕松應對檢測過程中涉及的分析需求。對于常見的曲線擬合，SoftMax Pro 7 提 供了多達 21 中擬合選擇，并且擬合的方式全部可以自定義，因此可用于多種酶活分析等。對于動力學檢測，SoftMax Pro 可自動 按需求輸出斜率、AUC、最高速度等等。對于光譜掃描，SoftMax Pro 則可自動導出最高吸收峰波長等。只需點擊一次，數(shù)據(jù)采 集到分析到輸出就可一次完成。