主要用途

YIJI細(xì)胞蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性合成底物磷酸化多肽，在PP2A去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，采用比色法測(cè)定其峰值的變化，以此進(jìn)行測(cè)算單位酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復(fù)合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶2A活性及其抑制劑的檢測(cè)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

蛋白磷酸化酶2A（protein phosphatase 2A；PP2A；EC 3.1.3.16），又稱為2型蛋白絲/蘇氨酸磷酸化酶，催化亞體，α異構(gòu)體（type II protein serine/threonine phosphatase catalytic subunit，alpha isoform），是主要的絲/蘇氨酸磷酸化酶成員之一，從酵母到人類高度進(jìn)化保留。其功能與細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、RNA剪切、轉(zhuǎn)譯等有關(guān)。PP2A的結(jié)構(gòu)為異源三體，包括結(jié)構(gòu)亞體、調(diào)節(jié)/目標(biāo)亞體和催化亞體。PP2A的目標(biāo)蛋白是腫瘤信號(hào)通路的蛋白分子，例如Raf，MEK，Akt等�；�于特異性底物磷酸化多肽RKpTIRR，在抑制劑黑海綿酸（okadaic acid）存在與否的情況下，受到蛋白磷酸化酶2A的去磷酸化作用，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后，在分光光度儀下（660nm波長(zhǎng)）產(chǎn)生峰值的變化，由此測(cè)定黑海綿酸敏感性蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的特異活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI陰性液（Reagent D）   毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E） 微升

YIJI顯色液（Reagent F） 毫升

YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 微升

YIJI專性液（Reagent H） 微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI緩沖液（Reagent C）、YIJI反應(yīng)液（Reagent E）、YIJI顯色液（Reagent F）和YIJI專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證6月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（5 X 10⁶細(xì)胞）
2. 小心加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞
5. 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11. 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12. 置于冰槽里孵育30分鐘
13. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15. 移取2微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YIJI30030.1）
16. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為660nm，并置零
3. 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
4. 按下表分別加入YIJI陰性液（Reagent D）和YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到每個(gè)離心管，混勻
5. 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1. 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿
2. 在30℃溫度下孵育20分鐘
3. 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
4. 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
5. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
6. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次
7. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

• 樣品背景測(cè)定

1. 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）
3. 在30℃溫度下孵育20分鐘
4. 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D），混勻
5. 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
6. 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度

• 樣品總活性測(cè)定

1. 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）
3. 在30℃溫度下孵育2分鐘
4. 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
5. 在30℃溫度下孵育20分鐘
6. 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D），混勻
7. 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
8. 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
9. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
10. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)磷濃度

• 樣品非特異性活性測(cè)定

1. 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）
3. 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）
4. 在30℃溫度下孵育5分鐘
5. 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
6. 在30℃溫度下孵育20分鐘
7. 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D），混勻
8. 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
9. 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
10. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
11. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)磷濃度

• 計(jì)算樣品活性

1. 樣品總活性和非特異活性
2. 樣品特異活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為25次（10個(gè)樣本）操作，包括5次（點(diǎn)）標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定
2. 操作時(shí)，須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定只需1條
4. 樣品背景讀數(shù)大于1.0，建議稀釋樣品至0.5-1.0之間
5. 如果加樣精準(zhǔn)，樣品背景讀數(shù)可以跳過
6. YIJI顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
7. 樣品切忌使用磷酸緩沖液、EDTA、EGTA和脫氧膽酸納處理
8. 如果使用免疫沉淀復(fù)合物作為待測(cè)樣品，建議使用YIJI通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A樹脂）試劑盒－YIJI30029.1
9. 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
10. 建議使用比色皿測(cè)定
11. 如果使用96孔板測(cè)定，建議反應(yīng)孵育時(shí)，置于平式搖蕩儀搖蕩孵育，速度為50RPM
12. 如果用戶沒有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代
13. 吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性
14. 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YIJI30030.1）
15. 蛋白磷酸化酶2A活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的磷
16. 本公司提供系列蛋白磷酸酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確