介紹

在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)中，對(duì)核酸和蛋白進(jìn)行定量是許多復(fù)雜實(shí)驗(yàn)必要的上游檢測(cè)。雖然已有多種檢測(cè)方法，但是最常用的仍然是紫外分光光度法。紫外分光光度法的原理是利用分子在固定波長范圍吸收光和散射光，在朗伯比爾定律(方程式1)的基礎(chǔ)上計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的濃度。這種方法還需要提前知道樣品的摩爾消光系數(shù)和通路長度。

A = εcL

方程式1：朗伯比爾定律是指吸光度(A)等于分子摩爾消光系數(shù)(ε)乘以濃度(c)和通路長度(L)。變換等式后我們可以利用吸光度來計(jì)算濃度。

核酸定量已經(jīng)是一門非常成熟的檢測(cè)技術(shù)了，并且與最初相比其檢測(cè)原理并未發(fā)生太多的改變。我們可以在260nm波長下檢測(cè)核酸濃度，并且可以利用230nm和280nm波長檢測(cè)樣本純度。

我們同樣可以用紫外分光光度法對(duì)蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行定量，然而除此之外還有更多更準(zhǔn)確的比色測(cè)定法。紫外分光光度法利用色氨酸的芳香結(jié)構(gòu)特性吸收280nm波長的光，濃度的計(jì)算依賴于氨基酸序列上的不同含量的色氨酸殘基。另外，二喹啉甲酸(BCA)蛋白實(shí)驗(yàn)可以在不依賴于氨基酸序列和長度的情況下檢測(cè)蛋白濃度。此方法是在堿性條件下利用雙縮脲反應(yīng)使氨基酸骨架和銅離子形成帶顏色的螯合物進(jìn)行測(cè)定的。

SpectraMax® ABS Plus 是一款理想的進(jìn)行這些定量實(shí)驗(yàn)的紫外可見光譜微孔讀板機(jī)。在這里，我們展示了幾種不同的將ABS Plus reader 和 SpectraDrop^TM MicroVolume Microplate and SoftMax® ProSoftware 相結(jié)合用來定量檢測(cè)雙鏈 DNA和牛血清白蛋白 ( BSA ) 的方法。

優(yōu)勢(shì)

- 更寬的波長檢測(cè)范圍：190 - 1000 nm
- 配合使用超微量板可大大節(jié)省樣品的上樣量
- SoftMax Pro 軟件預(yù)置模板使得操作更加簡便

材料

- SpectraMax ABS Plus 微孔板讀板機(jī)(Molecular Devices cat. #ABS Plus)
- SpectraDrop 超微量板 (Molecular Devices cat. #0200-6262)
- 96 孔平底透明塑料板 (Greiner Bio-Onecat. #655101)
- UltraPure^TM 小牛胸腺 DNA 溶液 (ThermoFisher Scientific cat. #15633019)
- Pierce BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒 (ThermoFisher Scientific cat. #23225)
- Pierce^TM 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 Ampules, 2mg/mL (ThermoFisher Scientific cat.#23209)
- UV-Star® 96 孔板 (Greiner Bio-Onecat. #655801)

方法

DNA 定量

1000 ng/μL 的超純小牛胸腺雙鏈 DNA，用1x PBS 倍比稀釋。將 2 或 4 μL 樣品加入 64 孔 SpectraDrop 微量板中，并用0.5 mm 或 1.0 mm 蓋玻片蓋住樣品。打開 SoftMax Pro 軟件中預(yù)先設(shè)置好的程序“SpectraDrop DNA Quantitation”，按照默認(rèn)設(shè)置對(duì)板進(jìn)行讀數(shù)。數(shù)據(jù)結(jié)果用雙對(duì)數(shù)曲線進(jìn)行表示，SoftMax Pro 軟件會(huì)進(jìn)一步生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，通過范圍為 220 nm 至 350 nm，步進(jìn)為 4 mm 的光譜掃描可以檢測(cè)樣品純度。

我們也比較了運(yùn)用比色皿和微孔板進(jìn)行DNA 定量檢測(cè)的優(yōu)劣。待測(cè)樣品按照倍比稀釋為 250 ng/μL 至 0.5 ng/μL，然后加入紫外透明 96 孔微孔板中 ( 每孔 200μL )或者紫外可見比色皿中 (1000 μL)。我們用 SpectraMax ABS Plus 微孔讀板機(jī)在 260 nm 對(duì)樣本進(jìn)行了檢測(cè)。數(shù)據(jù)結(jié)果用雙對(duì)數(shù)曲線進(jìn)行表示，SoftMax Pro 軟件會(huì)進(jìn)一步生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蛋白質(zhì)定量

按照 BCA 實(shí)驗(yàn)試劑盒提供的步驟稀釋蛋白樣本并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將 25 μL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和 200 μL BCA 反應(yīng)液加入 96 孔微孔板中37°C 孵育 30 min。用 SoftMax Pro 軟件打開預(yù)設(shè)程序“BCA”，在 562 nm 波長條件下讀數(shù)。數(shù)據(jù)用二次方曲線擬合，進(jìn)而用 SoftMax Pro 軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果

ABS Plus 微孔讀板機(jī)可以在微量和標(biāo)準(zhǔn)微孔板條件下定量檢測(cè)雙鏈 DNA 濃度。利用SpectraDrop 微量板和預(yù)設(shè)程序，ABS Plus微孔讀板機(jī)可以檢測(cè)到濃度低至 2 ng/μL體積為 4 μL 的樣本，并且可以同時(shí)測(cè)量計(jì)算相關(guān)參數(shù)如 A₂₆₀ / A₂₈₀ 和 A₂₆₀ / A₂₃₀ 比例 ( 圖 1 和 圖 2 )。光譜掃描可以進(jìn)一步檢測(cè)樣本是否被污染 ( 圖 3 )。另外，ABSPlus 微孔讀板機(jī)可以用微孔板方法對(duì)雙鏈DNA 定量。利用紫外區(qū)透光型微孔板，讀板機(jī)可以檢測(cè)濃度低至 0.02 ng/μL 的雙鏈DNA ( 圖 4 )。最后，SpectraMax ABSPlus 微孔讀板機(jī)可以在 BCA 濃度測(cè)定法的基礎(chǔ)上檢測(cè)蛋白濃度。按照試劑盒說明書的步驟檢測(cè) BSA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ( 圖 5 )。

結(jié)論

SpectraMax ABS Plus 微孔讀板機(jī)是一款簡單可靠的儀器，支持多種檢測(cè)方法，如比色皿和微孔板，進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)定量的微孔板檢測(cè)儀器。如果和 SpectraDrop超微量板搭配使用，此讀板機(jī)可以一次定量 64 個(gè)體積低至 2 μL 的樣本。另外，SoftMax Pro 軟件的預(yù)設(shè)模板程序可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并且能更快得到結(jié)果。