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云序生物最新m6A“RNA甲基化”研究匯總—病毒篇

瀏覽次數(shù)：3983　發(fā)布日期：2018-6-11　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

RNA甲基化領域是當前最耀眼的國際科研明星，也是國自然申請的大熱點；究其原因，是因為最近一兩年，RNA甲基化的功能與分子機制方面取得了巨大的進展。RNA甲基化已被證實在癌癥發(fā)生發(fā)展，病毒感染，神經(jīng)發(fā)育，干細胞分化等過程中發(fā)揮著關鍵作用。今天，我們承接上一期的癌癥篇，為您帶來病毒領域的RNA甲基化研究進展。

1.Nature Immunology：DDX46影響抗病毒RNA的去m6A甲基化，抑制細胞的抗病毒免疫應答

影響因子：21.5，2017.8.28

中國醫(yī)學科學院聯(lián)合上海第二軍醫(yī)大學團隊證實RNA解旋酶DDX46通過RNA去甲基化修飾，抑制水泡型口炎病毒（VSV）的天然免疫應答。那為什么作者會鎖定DDX46來做研究呢？因為大多數(shù)DDX家族成員參與mRNA剪接，其中有三個成員（DDX1，DDX3和DDX41）作為胞質感受器還參與了抗病毒的天然免疫反應。于是，作者希望能夠找到其它參與mRNA剪接且在核內影響宿主抗病毒反應的DDX家族成員。作者將DDX家族的7個成員（DDX5，17，23，39，42，46和48）作為候選，應用siRNA敲低其表達，發(fā)現(xiàn)只有敲低DDX46表達才能顯著增加VSV病毒感染后干擾素的產(chǎn)生。為進一步揭示DDX46功能，作者應用CLIP測序，發(fā)現(xiàn)DDX46與抗病毒基因（Mavs，Traf3和Traf6）通過與共有保守結構域CCGGUU結合而起作用。在分子機制上，作者以去甲基化酶ALKBH5為研究對象，應用RIP測序，發(fā)現(xiàn)感染病毒后細胞核內DDX46與ALKBH5結合顯著增加，使得與DDX46結合的抗病毒效應分子mRNA發(fā)生去甲基化修飾，導致復合物在核內滯留，抑制了抗病毒效應分子蛋白的表達，從而降低干擾素產(chǎn)生，最終抑制抗病毒天然免疫應答反應。

圖1. RIP測序檢測感染DDX46與ALKBH5結合的增加

2. Nature Microbiology：HIV病毒感染促進自身及宿主淋巴細胞的m6A RNA甲基化
2016.2.22

同樣來自Nature的子刊，加州大學圣地亞哥醫(yī)學院Tariq團隊利用HIV感染CD4淋巴細胞（該細胞為艾滋病病毒的主要攻擊對象），在病毒感染增殖期（感染后第3天）取樣進行實驗。作者應用m6A RNA甲基化測序和northern blot技術結合，證實HIV-1病毒感染淋巴細胞后，不管是病毒自身的RNA，還是宿主細胞的RNA，能促進RNA的甲基化反應。研究團隊應shRNA，在CD4 T淋巴細胞敲低m6A甲基轉移酶METTL3和METTL14，發(fā)現(xiàn)HIV-1的復制受到抑制，在敲低甲基轉移酶ALKBH5，發(fā)現(xiàn)促進了HIV的復制。作者通過m6A RNA甲基化測序，檢測到HIV RNA上有14個m6A甲基化peak，接著再應用m6A RNA甲基化測序，在受感染CD4 T淋巴細胞中篩選到56個因m6A甲基化修飾而差異表達的轉錄因子，GO分析表明這些轉錄因子和病毒基因的表達調控有密切關系。為了進一步研究病毒RNA甲基化位點功能，作者在第11個peak的莖環(huán)結構IIB區(qū)將A7877和A7883位點做甲基化處理，發(fā)現(xiàn)人類和病毒RNA中m6A修飾促進Rev蛋白和RRE RNA的結合，從而調控RNA出核。

圖2. HIV-1病毒感染CD4 T淋巴細胞后m6A修飾的作用機制

3. Cell Host & Microbe：m6A RNA甲基化修飾調控黃病毒感染

影響因子：14.9，2016.11.9

杜克大學醫(yī)學院Stacy研究團隊研究了m6A RNA甲基化修飾對丙型肝炎病毒（HCV）感染的影響。他們發(fā)現(xiàn)，在Huh7細胞內利用siRNA敲低甲基轉移酶METTL3和METTL14后，HCV的非結構蛋白NS5A的表達明顯升高，當敲低去甲基化酶FTO后，NS5A蛋白表達明顯降低。由于NS5A蛋白與HCV的復制密切相關，以上研究表明m6A相關的酶系統(tǒng)調控HCV感染。研究人員還發(fā)現(xiàn)，YTHDF蛋白可以識別HCV RNA，并負調控HCV子代病毒的產(chǎn)生。由于HCV病毒的復制主要位于細胞內的脂質體內，他們利用免疫熒光技術對HCV感染的細胞內的YTHDF蛋白進行了定位，發(fā)現(xiàn)HCV感染誘導YTHDF蛋白向脂質體的定位，識別并結合HCV RNA，還在其他黃病毒屬病毒包括登革病毒（DENV2）、黃病毒（YFV）、寨卡病毒（ZIKV）和西尼羅病毒（WNV）中也應用m6A RNA甲基化測序檢測到m6A修飾位點。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)細胞質內復制的HCV病毒存在m6A修飾，在病毒的生命周期內扮演重要角色，這也為黃病毒屬疫苗的研究提供了新的切入點。

圖3.黃病毒屬病毒m6A RNA修飾調控病毒感染機制

4.Cell Host Microbe：寨卡病毒感染過程中病毒及宿主的m6A RNA甲基化修飾的動態(tài)變化

影響因子：14.9，2016.11.9

加州圣地亞哥大學學者發(fā)現(xiàn)m6A甲基化不但影響寨卡病毒自身的轉錄，還影響宿主RNA的結構和功能，并闡明了相關作用機制。作者首先應用m6A RNA甲基化測序，檢測到m6A在寨卡病毒中高表達。接著，在293T細胞內利用shRNA敲低甲基轉移酶METTL3和METTL14以及去甲基化酶ALKBH5和FTO后，應用RIP測序和Real-time PCR結合，檢測寨卡病毒體內RNA表達量，以上研究表明m6A相關酶系統(tǒng)調控m6A的甲基化與去甲基化，從而負調控病毒的復制。作者應用敲降技術，敲低YTHDF1-3蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)任意單獨敲除一種蛋白后，都可促進寨卡病毒的復制，并且敲低YTHDF 2蛋白后，對病毒復制的促進作用最強。為驗證敲降結果，作者構建YTHDF1-3蛋白與pcDNA的重組質粒，分別轉染至293T細胞，發(fā)現(xiàn)病毒的復制受到抑制，并且YTHDF 2的抑制作用最強。敲降和過表實驗共同說明，YTHGF 1-3參與了寨卡病毒感染的過程，并且YTHGF 2蛋白作用最顯著。為進一步研究YTHGF 2蛋白作用機制，作者應用WB技術，檢測到YTHGF 2在敲低METTL14或ALKBH5的細胞中高表達，并應用RT-qPCR技術，檢測到敲低ALKBH5后，能顯著促進病毒復制，而METTL14抑制病毒復制，說明ALKBH5通過直接結合YTHGF 2，參與病毒復制過程。總體來說，本研究揭示了受寨卡病毒感染宿主細胞內m6A相關酶的作用機制。

圖4.宿主體內寨卡病毒的作用機制

5. eLIFE：m6A RNA甲基化調控HIV-1病毒感染和Gag蛋白表達

影響因子：7.7，2016.7.2

與加州大學一樣，來自俄亥俄州立大學團隊也研究了HIV-1 RNA m6A修飾與病毒感染和基因表達的關系。作者應用RIP測序和m6A RNA甲基化測序，發(fā)現(xiàn)HIV-1感染CD4 Jurkat細胞，CD4 T淋巴細胞或293T細胞后，發(fā)現(xiàn)m6A在細胞間的修飾位置相似，主要分布在基因組非編碼區(qū)。接著，作者應用CLIP和m6A RNA甲基化測序，檢測過表達HIV-1病毒后，Hela或CD4細胞中YTHDF1-3蛋白的表達量，旨在檢測YTHDF蛋白是否能與病毒的m6A位點結合。結果發(fā)現(xiàn)三種YTHDF蛋白都可識別并結合HIV-1 RNA中的m6A修飾位點。那么既然蛋白和位點是能夠結合的，那么它們之間是在何處，在何時，又發(fā)揮著何種功能呢？作者接著在人類癌癥細胞系中應用過表達和敲降技術做功能驗證，證實YTHDF蛋白在HIV-1病毒復制過程中發(fā)揮負調控作用。并且，抑制蛋白表達后，病毒Gag蛋白的表達明顯抑制，而通過敲降去甲基化酶AlkBH5，F(xiàn)TO或共抑制后，病毒Gag蛋白的表達明顯升高。

圖5. YTHDF蛋白負調控HIV-1病毒表達

6. PLoS Pathogens：m6A RNA甲基化影響不同類型細胞感染Kaposi肉瘤病毒后的調控模式

影響因子：6.6，2018.4.16

伯克利大學Britta團隊首次揭示了感染Kaposi肉瘤病毒（KSHV）后，細胞中m6A的分布情況，發(fā)現(xiàn)YTHDF2蛋白在核內發(fā)揮作用。作者應用超高液相色譜法，發(fā)現(xiàn)受KSHV病毒感染的iSLK 219細胞（是研究病毒裂解細胞的模式細胞），其RNA m6A甲基化位點修飾比對照組高3倍，說明病毒感染細胞可促進m6A甲基化的修飾。作者通過m6A RNA甲基化測序研究病毒裂解宿主細胞期間細胞RNA中m6A的表達量，發(fā)現(xiàn)m6A甲基化程度與細胞裂解程度呈成反比。為驗證m6A RNA甲基化測序結果，作者應用RIP測序和Real-time PCR技術檢測一條與抗病毒相關通路上6個基因的結合和表達量，發(fā)現(xiàn)該通路的確參與了KSHV病毒的表達，與m6A RNA甲基化轉錄組功能預測的結果一致。作者假設m6A在KSHV病毒生命周期中起關鍵作用。通過siRNA敲低iSLK 219和iSLK BAC 16細胞中METTL3或YTHDF1-3蛋白的表達，使分別其感染正常293T細胞，發(fā)現(xiàn)病毒的復制受抑制，并且病毒裂解反式激活因子ORF50也受到了抑制。通過對比兩種細胞的m6A分布，作者發(fā)現(xiàn)在iSLK 219細胞中，m6A主要調控前病毒模式，而在iSLK BAC 16細胞中，m6A主要調控后病毒模式。綜上，本研究證實了m6A參與了病毒感染的通路，并且在不同的細胞類型中差異很大。