介紹

Ca_v1.3是一種L型電壓門控鈣通道，是藥物發(fā)現(xiàn)的重要治療靶點(diǎn)。有研究表明，一些藥物對(duì)Ca_v1.3通道產(chǎn)生了狀態(tài)依賴性的效應(yīng)¹，這意味著這些藥物的效應(yīng)隨著膜電位的變化(Vm)以及隨之而來的通道狀態(tài)的改變(開放、關(guān)閉、失活)而發(fā)生變化。由于這可能為病理上過度激活的Ca_v1.3通道提供了高度期望的選擇性，因此，對(duì)高通量分析方法的開發(fā)需求日益增長，以評(píng)估通道阻斷劑的不同狀態(tài)下的效應(yīng)。

目前的篩選方法采用電生理學(xué)或熒光法，利用鉀離子來調(diào)節(jié)膜電位，但兩種方法都有很大的局限性。電生理學(xué)直接控制Vm，但它是侵入性的且并不是很適合高通量的檢測(cè)分析模式，而熒光測(cè)定法則具有較差的生理相關(guān)性，而且是不可逆的。

為了解決這些局限性，我們?cè)谶@里報(bào)告了一種新的解決方案，它利用光遺傳學(xué)方法通過光敏感通道-2(channelrhodopsin-2，ChR2)²來控制Vm。ChR2是一種光門控機(jī)制的非選擇性陽離子通道，主要用于通透鈉離子(Na+)。當(dāng)通過藍(lán)光(470nm)激活時(shí)，ChR2介導(dǎo)Na⁺的流入，從而延長了膜的去極化，使Ca_v1.3通道首先進(jìn)入開放狀態(tài)，然后逐漸進(jìn)入失活狀態(tài)。在光激活終止后，膜電位再極化，這將使Ca_v1.3通道回到它的靜息狀態(tài)。在這項(xiàng)研究中,我們將使用FLIPR系統(tǒng)展示一種光遺傳學(xué)方法的新應(yīng)用來控制Vm，進(jìn)行可逆且精確的方式來篩選狀態(tài)依賴性鈣通道阻斷劑。

材料

- HEK-293細(xì)胞系聯(lián)合表達(dá)ChR2D156A(來源于萊茵衣藻)，人源的Ca_v1.3α1+α2δ,Β亞基，以及人源的K_ir2.3是由意大利米蘭的AxxamS.p.A提供。K_ir2.3的表達(dá)首先將Vm設(shè)置為超極化值，在全反式視網(wǎng)膜輔因子存在的情況下，它可以對(duì)胞外高鉀離子(作用于K_ir2.3)，或藍(lán)色光刺激的ChR2進(jìn)行去極化。在這兩種情況下，去極化的Vm都會(huì)導(dǎo)致Ca_v1.3打開，允許鈣進(jìn)入細(xì)胞。

- FLIPR^TETRA系統(tǒng)(0310-5147),FLIPR^®鈣6檢測(cè)試劑盒(R8190)和FLIPR^®膜電位檢測(cè)試劑盒(R8042)，均來自于都從Molecular Devices公司。

優(yōu)勢(shì)

- 通過光的應(yīng)用，開發(fā)出靶向特異性和非侵入性的檢測(cè)方法。
- 靈活的、可逆的檢測(cè)方案
- 數(shù)據(jù)質(zhì)量達(dá)到電生理以及鉀離子刺激等方法檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)

方法

光遺傳學(xué)的一個(gè)強(qiáng)大應(yīng)用是利用光敏驅(qū)動(dòng)器控制Vm。在本研究中，C.reinhardtii的光敏ChR2蛋白被用于控制Vm，作為對(duì)狀態(tài)依賴性Ca_v1.3阻斷劑的高通量分析檢測(cè)的基礎(chǔ)。具體地說，ChR2_D156A突變體在FLIPR Tetra系統(tǒng)上被其LED所發(fā)出的藍(lán)光(470nm)激活，這使得由于其對(duì)Na⁺的滲透性和開放狀態(tài)下約為6.9分鐘的延長的時(shí)間常數(shù)³，導(dǎo)致了一種超強(qiáng)的且被延長的膜去極化。由于Vm的去極化，Ca_v1.3通道首先打開允許Ca²⁺離子進(jìn)入細(xì)胞，(圖1)，并隨著時(shí)間的推移進(jìn)入失活狀態(tài)(圖2)。使用FLIPR鈣6檢測(cè)試劑盒觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動(dòng)態(tài)變化。

用ChR2控制Vm

作為驗(yàn)證Vm控制的第一步，用FLIPR膜電位染料(Ex530nm/Em565nm)測(cè)量熒光信號(hào)的變化，這是Vm變化的結(jié)果。HEK-293細(xì)胞經(jīng)ChR2、K_ir2.3、Ca_v1.3轉(zhuǎn)染后，在全反式視網(wǎng)膜輔因子存在的情況下，按照標(biāo)準(zhǔn)流程FLIPR膜電位染料孵育。利用FLIPR^TETRA系統(tǒng)，利用藍(lán)色發(fā)光二極管的光脈沖刺激ChR2通道來誘導(dǎo)膜去極化。第二種方案是同時(shí)進(jìn)行的，它能激發(fā)膜電位染料，并隨著時(shí)間的推移測(cè)量熒光發(fā)射的變化。熒光信號(hào)的增加反映了膜的去極化。在第一次藍(lán)光刺激結(jié)束后，ChR2通道進(jìn)入關(guān)閉狀態(tài)，允許Vm重新極化，從而導(dǎo)致熒光信號(hào)隨時(shí)間減少。

ChR2對(duì)Ca_v1.3的控制

HEK-293細(xì)胞經(jīng)ChR2、K_ir2.3、Ca_v1.3轉(zhuǎn)染后，首先在全反式視網(wǎng)膜輔因子存在的情況下，加入了FLIPR鈣6染料進(jìn)行孵育。使用FLIPR Tetra系統(tǒng)，細(xì)胞用藍(lán)光脈沖刺激ChR2，而熒光的變化則通過Ca_v1.3反映鈣進(jìn)入細(xì)胞。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，使用了雙脈沖刺激方案，在第一次脈沖后，第二次光脈沖在第一次脈沖后應(yīng)用于失活的Ca_v1.3恢復(fù)。

高鉀條件下對(duì)Ca_v1.3的調(diào)控

作為參考，在同一細(xì)胞系上進(jìn)行了高鉀條件下分析Ca_v1.3通道活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。當(dāng)高鉀離子被添加到細(xì)胞外液中時(shí)，膜電位去極化使得Ca_v1.3通道打開，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞(圖1)。隨著時(shí)間的推移，Ca_v1.3進(jìn)入失活的非導(dǎo)電狀態(tài)。用FLIPR鈣6染料測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。該方法要求高濃度的K+對(duì)非生理的細(xì)胞具有許多“非靶向”效應(yīng)。此外，這種應(yīng)用是不可逆轉(zhuǎn)的，因?yàn)殁涬x子不能從孔板中去除。

藥理學(xué)

為了驗(yàn)證光遺傳學(xué)在藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的效用，一組實(shí)驗(yàn)采用了狀態(tài)依賴性抑制劑依拉地平來阻斷Ca_v1.3通道，并在關(guān)閉和失活狀態(tài)下分析IC₅₀的結(jié)果。三種方法激活Ca_v1.3通道，包括光遺傳學(xué)、基于K_ir2.3的高鉀添加、和膜片鉗檢測(cè)方法，比較兩種狀態(tài)下的依拉地平的IC₅₀值。

結(jié)果

通過ChR2調(diào)控Vm

通過用FLIPR膜電位染料孵育ChR2轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞，驗(yàn)證了光激活ChR2對(duì)膜電位的調(diào)控。由FLIPR^TETRA系統(tǒng)LED發(fā)出的藍(lán)光脈沖導(dǎo)致膜去極化，而FLIPR膜電位染料的信號(hào)增加了3倍(圖3a)。隨著時(shí)間的推移，膜電位信號(hào)的記錄顯示，當(dāng)細(xì)胞膜重新極化時(shí)，從最初的藍(lán)光刺激到大約30分鐘后，熒光信號(hào)返回到背景水平。這一數(shù)據(jù)表明，當(dāng)藍(lán)色光刺激ChR2打開時(shí)，Vm首先被去極化，隨著時(shí)間的推移，隨著ChR2通道關(guān)閉Vm重新極化(圖3b)，它的時(shí)間常數(shù)為6.9分鐘。

ChR2誘導(dǎo)的Ca_v1.3反應(yīng)

轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞與FLIPR鈣6染料孵育。隨著鈣離子進(jìn)入細(xì)胞(圖4A)，藍(lán)色發(fā)光二極管發(fā)出的光脈沖觸發(fā)了熒光信號(hào)的增加。隨后的實(shí)驗(yàn)(圖4B)中，使用雙脈沖檢測(cè)方案的細(xì)胞來識(shí)別Ca_v1.3通道從失活狀態(tài)恢復(fù)的時(shí)間依賴性。10分鐘間隔后，記錄到了原始鈣流一半的信號(hào)。45分鐘間隔后，幾乎100%的信號(hào)被記錄下來。數(shù)據(jù)顯示，在第一次光脈沖10分鐘后，一半的通道仍處于失活狀態(tài)，從而產(chǎn)生50%的最大鈣信號(hào)。

鉀離子的調(diào)控

用K⁺調(diào)控Ca_v1.3通道的狀態(tài)，轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞系中加載FLIPR鈣6染在37°C下孵育一小時(shí)，添加緩沖液增加鉀離子濃度從4mM到75mM以形成不同的膜電位(Vm)。然后在FLIPR^TETRA系統(tǒng)中檢測(cè)鈣信號(hào)時(shí)添加75mM的高濃度K⁺。代表性的鈣信號(hào)響應(yīng)如圖5A所示。K+依賴的失活曲線展示了與K⁺濃度對(duì)應(yīng)的FLIPR鈣6染料信號(hào)，數(shù)據(jù)顯示誘發(fā)的50%最大Ca²⁺信號(hào)的鉀離子濃度是22mM(圖5B)，這表明在添加了此濃度的鉀離子條件下有一半的Ca_v1.3通道處于失活狀態(tài)。

藥理學(xué)

依拉地平是一種抗高血壓藥物，它也可能有助于減緩帕金森疾病癥狀的發(fā)展，因其對(duì)Ca_v1.3的狀態(tài)依賴性影響而被選為這項(xiàng)研究的對(duì)象。采用ChR2的光遺傳學(xué)檢測(cè)方案，表達(dá)了Ca_v1.3的HEK-293細(xì)胞在添加不同濃度依拉地平的情況下，用FLIPR鈣6染料在37°C下孵育一小時(shí)。在FLIPR^TETRA系統(tǒng)上采用藍(lán)色光脈沖進(jìn)行刺激，檢測(cè)到通道關(guān)閉狀態(tài)下鈣流熒光信號(hào)的強(qiáng)度的增加。10分鐘后，給予了第二次藍(lán)色光脈沖刺激，記錄到了通道失活狀態(tài)下鈣流熒光信號(hào)的變化。僅觀察到原始鈣流信號(hào)一半強(qiáng)度的熒光信號(hào)。在圖6A中，結(jié)果顯示為Ca_v1.3通道效應(yīng)的%。高K⁺調(diào)控方案記錄的依拉地平的IC₅₀曲線如圖6B所示。在較早的鉀離子調(diào)控實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將4mMK⁺或22mMK⁺添加到FLIPR鈣6染料的加載緩沖液中，分別誘導(dǎo)關(guān)閉和失活狀態(tài)。在FLIPR^TETRA系統(tǒng)中檢測(cè)鈣信號(hào)時(shí)添加了75mMK⁺。膜片鉗方法下檢測(cè)的Ca_v1.3通道關(guān)閉和失活狀態(tài)下依拉地平的IC₅₀曲線如圖6C所示。

總結(jié)

包括膜片鉗結(jié)果在內(nèi)的所有Ca_v1.3通道關(guān)閉和失活狀態(tài)下依拉地平的IC₅₀值得比較如表1所示。與關(guān)閉狀態(tài)下的值相比，所有檢測(cè)方法下得到的在失活狀態(tài)下的IC₅₀值的左移大約為10倍。這很重要，因?yàn)閷?duì)離子通道的復(fù)合效應(yīng)在通道關(guān)閉和失活狀態(tài)下可能具有不同的臨床意義。通過光遺傳學(xué)檢測(cè)方案，IC₅₀值更接近于以電生理方法獲得的IC₅₀值。光遺傳學(xué)所獲得的“阻斷比例”值與電生理學(xué)方法所獲得的值高度相似，從而提示其高生物相關(guān)性。與電生理學(xué)不同的是，光遺傳學(xué)檢測(cè)中的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)完好無損。此外，光驅(qū)動(dòng)的光遺傳檢測(cè)是可逆的，這是靈活的分析方法的一個(gè)非常理想的特性。

致謝

實(shí)驗(yàn)工作和數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)由意大利米蘭的AxxamS.p.A提供。

參考文獻(xiàn)

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