策略1 Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1 非肌細(xì)胞對成體心臟中的肌細(xì)胞沒有貢獻(xiàn)

使用Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠來同時追蹤成體心臟中的心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色顯示tdTomato+細(xì)胞是TNNI3+心肌細(xì)胞，而ZsGreen+細(xì)胞不是TNNI3+心肌細(xì)胞（圖1G）。 分離Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1的心肌細(xì)胞進(jìn)行體外觀察也沒有檢測到ZsGreen+心肌細(xì)胞（圖1H）。 因此，Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1系統(tǒng)用兩種不同的熒光標(biāo)記了肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞（圖1I）。

圖1.G-I

非肌細(xì)胞在成體心臟中是否會分化成肌細(xì)胞呢？如果是，那么源自非肌細(xì)胞的新心肌細(xì)胞將是ZsGreen+的。而實驗結(jié)果是：在Dox誘導(dǎo)后，對Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠進(jìn)行結(jié)扎左前降支冠狀動脈誘導(dǎo)MI造模（圖2A）。心肌梗塞后，造成心肌細(xì)胞大量死亡，心臟功能受損，在損傷后2-4周，對心臟切片進(jìn)行ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)ZsGreen+TNNI3+的心肌細(xì)胞（圖2B）。在5個心梗組織的600多個切片中，都沒有檢測到ZsGreen+tdTomato-心肌細(xì)胞。流式細(xì)胞分析（圖2D）和熒光顯微鏡（圖2E）也證實在Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的MI造模后的心臟中也沒有觀察到ZsGreen+心肌細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果也只有tdTomato的表達(dá)，沒有ZsGreen的mRNA表達(dá)（n=5，圖2F）。這些數(shù)據(jù)表明，非心肌細(xì)胞在成體心臟的心臟損傷后對肌細(xì)胞沒有貢獻(xiàn)。

圖2. A-F

平行地，將骨骼肌損傷后骨骼肌中非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的細(xì)胞命運轉(zhuǎn)化作為陽性對照。骨骼肌在穩(wěn)態(tài)維持過程中，肌纖維細(xì)胞與非肌肉細(xì)胞發(fā)生融合，肌纖維細(xì)胞處于多核狀態(tài)，因此在正常骨骼�。�假手術(shù)組）中，可以檢測到tdTomato+ ZsGreen+肌細(xì)胞（圖2G）。而當(dāng)對Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的脛骨前肌（TA�。�實施BaCl2損傷后，骨骼肌中肌纖維細(xì)胞大量死亡，TA肌損傷后可以檢測到弱tdTomato熒光信號和強(qiáng)ZsGreen表達(dá)，表明在BaCl2造模后ZsGreen+細(xì)胞逐漸取代tdTomato+細(xì)胞（圖2G）。與假手術(shù)組相比，在受損TA肌中可以檢測到ZsGreen+tdTomato-肌細(xì)胞（箭頭，圖2G），說明非肌細(xì)胞重新形成肌細(xì)胞。

圖2. G

綜合上述結(jié)果，通過Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1（策略1）的雙同源重組譜系示蹤技術(shù)揭示了在胚胎心臟和成體骨骼肌中非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，但在成體心臟中非肌細(xì)胞對肌細(xì)胞沒有貢獻(xiàn)。

策略2 Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3 反向Cre/Dre 系統(tǒng)在非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究中標(biāo)記兩種細(xì)胞

設(shè)計第2個雙同源重組譜系示蹤系統(tǒng)用來驗證非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。該系統(tǒng)由Tnnt2-Cre（肌細(xì)胞中表達(dá)Cre）、他莫昔芬誘導(dǎo)型 R26-DreER 和IR3報告小鼠組成。利用IR3報告小鼠（見下圖）可排它性地將非肌細(xì)胞標(biāo)記上tdTomato紅色熒光，將肌細(xì)胞特異性地標(biāo)記上ZsGreen綠色熒光。

Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠就可以同時標(biāo)記肌細(xì)胞（ZsGreen+）和非肌細(xì)胞（tdTomato+）（圖3A）。

圖3. A

胚胎E8.0天心臟中ZsGreen主要標(biāo)記原始心管（圖3B）。E8.0天給予他莫昔芬誘導(dǎo)，在E13.5天的右心室中發(fā)現(xiàn)tdTomato+非肌細(xì)胞對肌細(xì)胞有顯著貢獻(xiàn)（圖3C）。心臟切片免疫染色也證實了此結(jié)果（圖3D-F）。

同樣，在成體心臟和骨骼肌中，通過MI和BaCl2造模來觀察非心肌細(xì)胞的命運轉(zhuǎn)化（圖3G）。分離的心肌細(xì)胞的流式細(xì)胞分析（圖3H）和熒光顯微鏡（圖3I）分別結(jié)果也都顯示沒有tdTomato+心肌細(xì)胞。在形態(tài)上，這些tdTomato+細(xì)胞與ZsGreen+心肌細(xì)胞也明顯不同（圖3J）。

tdTomato和TNNI3免疫染色顯示這些tdTomato+細(xì)胞在MI心臟的梗塞區(qū)、邊界區(qū)和遠(yuǎn)端區(qū)均不會轉(zhuǎn)化為TNNI3+心肌細(xì)胞（圖3K）。來自5個Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠心臟的超過600個組織切片中均未檢測到tdTomato+TNNI3+心肌細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果也同樣指出分離的心肌細(xì)胞只表達(dá)ZsGreen，不表達(dá)tdTomato（圖3L）。

相反，在陽性對照實驗中，TA肌損傷模型中他莫昔芬誘導(dǎo)后可以很容易地檢測到tdTomato+ZsGreen-肌細(xì)胞（箭頭，圖3M），而假手術(shù)組沒有。

圖3.

綜合上述結(jié)果，第2種策略使用Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3也顯示出與策略1一致的結(jié)果：非心肌細(xì)胞在胚胎心臟和成體骨骼肌中轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞，但在成體心臟中對肌細(xì)胞沒有貢獻(xiàn)。

策略3 Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1

為了進(jìn)一步驗證上述發(fā)現(xiàn)，使用另一種肌細(xì)胞Marker——TNNI3來驅(qū)動Dre重組酶。 Tnni3-Dre在成體心臟中有效且特異性標(biāo)記肌細(xì)胞，但不標(biāo)記非肌細(xì)胞。利用Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠，分別標(biāo)記肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞（圖4A）。

圖4. A

通過ZsGreen、tdTomato和不同心臟細(xì)胞譜系marker的免疫染色顯示肌細(xì)胞表達(dá)tdTomato、非肌細(xì)胞（例如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）表達(dá)ZsGreen（補(bǔ)充材料）。不給予Dox誘導(dǎo)的情況下，在Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠中未觀察到ZsGreen+細(xì)胞組織（圖4B）。

給予Dox后兩周，進(jìn)行MI或BaCl2注射（圖4C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在假手術(shù)的心臟中，Dox誘導(dǎo)后使tdTomato+心臟細(xì)胞也被標(biāo)記上ZsGreen綠色熒光（圖4D）。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色顯示所有心肌細(xì)胞均為tdTomato+ZsGreen-（圖4E）。MI造模后，梗塞的心臟組織中tdTomato+肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，被ZsGreen+非肌細(xì)胞替代（圖4F）。

分離MI造模后的心肌細(xì)胞體外觀察均為tdTomato+ZsGreen-細(xì)胞（圖4G）。 tdTomato、ZsGreen和TNNI3免疫染色顯示ZsGreen+細(xì)胞在損傷后并沒有轉(zhuǎn)向心肌細(xì)胞命運（圖4H，I）。通過分流式細(xì)胞分析和RT-PCR沒有檢測到MI心臟中有任何ZsGreen+tdTomato-肌細(xì)胞（圖4J，K）。

相反，在陽性對照實驗中，在損傷的TA肌肉中可以檢測到ZsGreen+tdTomato-肌細(xì)胞（箭頭，圖4L），表明非肌細(xì)胞新生為肌細(xì)胞。

圖4.

所以，基于Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1的第3種模型也揭示了在成體心臟中非肌細(xì)胞并不轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞。

策略4 Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1 通過NR1系統(tǒng)研究非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

雖然利用廣泛型啟動子驅(qū)動的可誘導(dǎo)Cre或Dre可以有效標(biāo)記大多數(shù)非肌細(xì)胞，但實際上標(biāo)記效率并未達(dá)到100％。少數(shù)未標(biāo)記的非肌細(xì)胞在損傷后在成體心臟中產(chǎn)生新的肌細(xì)胞也仍舊是有可能的，雖然可能性并不大，因為在譜系示蹤期間的標(biāo)記過程是完全隨機(jī)的。為了達(dá)到100％的非肌細(xì)胞標(biāo)記效率，利用NR報告基因小鼠（見下圖），設(shè)計了第4種策略。

在這個系統(tǒng)中，ZsGreen標(biāo)記小鼠所有的細(xì)胞，除了被tdTomato標(biāo)記的新形成的肌細(xì)胞。Actb-Cre-loxP重組之后NR1小鼠中的所有細(xì)胞首先被標(biāo)記為ZsGreen綠色熒光，只有新的肌細(xì)胞在形成時由于第二個Tnnt2-Dre-rox的重組而開啟tdTomato紅色熒光的標(biāo)記（圖5A）。綠色熒光蛋白在哺乳動物細(xì)胞中有12-24小時的半衰期，所以盡管肌細(xì)胞中的Dre-rox重組會導(dǎo)致tdTomato表達(dá)，但ZsGreen蛋白在降解前仍有穩(wěn)定的標(biāo)記時間。因此可以在非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化期間檢測到雙陽性細(xì)胞。

圖5. A

首先分析之前實驗中的胚胎心臟（圖5B）來測試這個系統(tǒng)。很容易在E8.5天發(fā)育的心臟流出道中檢測到tdTomato+ZsGreen+肌細(xì)胞（箭頭，圖5C），這與以前的研究結(jié)果一致，表明第二心區(qū)祖細(xì)胞在這個階段分化成心肌細(xì)胞。

然后，在MI造模28天期間每12小時間隔收集小鼠心臟樣本進(jìn)行分析（圖5B）。對于ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，結(jié)果顯示在梗塞心肌中沒有ZsGreen+tdTomato+肌細(xì)胞（圖5D）。所有56個時間點的Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心臟樣本，超過6000個心臟切片中未檢測到任何ZsGreen+tdTomato+肌細(xì)胞。類似地，分離心肌細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析在ZsGreen+細(xì)胞中也沒有發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞（圖5E）。

相反，陽性對照實驗中很容易在受損TA肌肉中檢測到ZsGreen+tdTomato+肌細(xì)胞（圖5F）。在Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心臟切片中非肌細(xì)胞100%被ZsGreen標(biāo)記（補(bǔ)充材料）。

圖5.

綜上所述，使用基于Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1的第4種譜系示蹤策略的結(jié)果顯示，非肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化只在胚胎期而不在成體心臟中出現(xiàn)。