環(huán)狀RNA結(jié)合功能蛋白！找對(duì)方向20分文章水到渠成

瀏覽次數(shù)：3697　發(fā)布日期：2018-4-17　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

環(huán)狀RNA作為研究持續(xù)火熱的明星分子，不同于對(duì)其豐富的表達(dá)譜研究，環(huán)狀RNA功能機(jī)制研究還僅僅處在起步階段。環(huán)狀RNA研究多為miRNA海綿機(jī)制，部分circRNA可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，解除miRNA對(duì)靶基因的抑制作用，上調(diào)靶基因的表達(dá)。其實(shí)，環(huán)狀RNA可以通過(guò)結(jié)合不同種類的功能蛋白，分別在轉(zhuǎn)錄前、后及翻譯水平嚴(yán)格調(diào)控細(xì)胞生殖生長(zhǎng)等過(guò)程。云序曾對(duì)環(huán)狀RNA經(jīng)典研究思路進(jìn)行過(guò)詳細(xì)解析（2018國(guó)自然研究熱點(diǎn)—環(huán)狀RNA研究深度剖析），感興趣的老師可以查詢?yōu)g覽。4月3日，知名免疫學(xué)雜志Immunity（IF：22.845）在線發(fā)表了中科院生物物理所范祖森教授與王碩研究員為共同通訊作者的文章，介紹發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA Cia-cGAS定位于細(xì)胞核，可結(jié)合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，調(diào)控長(zhǎng)效造血干細(xì)胞（LT-HSC）靜息狀態(tài)。本文極大拓展了核內(nèi)環(huán)狀RNA通過(guò)結(jié)合激酶發(fā)揮重要生理功能的研究思路。

研究背景：

造血干細(xì)胞（HSC）自我更新和分化之間的平衡打破將導(dǎo)致骨髓衰竭及惡性血液腫瘤發(fā)生。然而，HSCs如何維持其靜止?fàn)顟B(tài)并避免I型干擾素（IFN）介導(dǎo)能量耗竭、細(xì)胞凋亡仍未可知。本文一種名為cia-cGAS的環(huán)狀RNA，它在長(zhǎng)效（LT）-HSCs細(xì)胞核中高度表達(dá)。小鼠Cia-cGAS缺陷將導(dǎo)致I型IFN在骨髓中高表達(dá)并伴隨靜息LT-HSC數(shù)量顯著減少。在穩(wěn)態(tài)條件下，cia-cGAS在細(xì)胞核中通過(guò)結(jié)合DNA傳感器cGAS以阻斷其合酶活性，由此保護(hù)靜息LT-HSC免于被cGAS介導(dǎo)耗盡凋亡。此外，cia-cGAS與線性cGAS相比，與cGAS結(jié)合親和力更強(qiáng)，由此抑制cGAS介導(dǎo)LT-HSCs中I型IFN產(chǎn)生。本文揭示了一個(gè)新型環(huán)狀RNA——cia-cGAS可結(jié)合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，調(diào)控長(zhǎng)效造血干細(xì)胞（LT-HSC）靜息狀態(tài)。

研究思路：

本文首先基于高通量手段比較了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全轉(zhuǎn)錄組變化，共發(fā)現(xiàn)156種顯著性差異表達(dá)的circRNAs。表達(dá)量驗(yàn)證證實(shí)9個(gè)circRNA在LT-HSC中顯著性上調(diào)。在細(xì)胞表型層面，發(fā)現(xiàn)只有干擾D430042O09Rik轉(zhuǎn)錄的circRNA——Cia-cGAS后，可明顯改變?cè)煅杉?xì)胞的亞群分布，作者因此錨定Cia-cGAS進(jìn)行機(jī)制分析。作者通過(guò)Cas-9基因敲除策略成功構(gòu)建了Cia-cGAS基因敲除小鼠，在Cia-cGAS基因敲除小鼠中LT-HSC顯著性減少，I型IFN表達(dá)升高。通過(guò)RNA Pull-down實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)Cia-cGAS可以與cGAS結(jié)合，cGAS-RIP實(shí)驗(yàn)反向證實(shí)二者之間具有直接的相互作用。后續(xù)，作者通過(guò)生信預(yù)測(cè)結(jié)合EMSA實(shí)驗(yàn)分析了Cia-cGAS與cGAS相互作用的位點(diǎn)信息。酶學(xué)研究證明，Cia-cGAS可通過(guò)結(jié)合cGAS并抑制其活性。

研究一：環(huán)狀RNA分子篩選及驗(yàn)證

為探索造血干細(xì)胞功能相關(guān)的circRNA分子，作者比較了小鼠不同造血干細(xì)胞（LT-HSC，ST-HSC和MPPs）中全轉(zhuǎn)錄組變化情況，找出了156種顯著性差異表達(dá)的circRNA分子，其中49種在LT-HSC中高表達(dá)。RNase R及qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中9種為真實(shí)LT-HSC中高表達(dá)環(huán)狀RNA 分子。為有效篩選造血干細(xì)胞相關(guān)的circRNA分子，作者通過(guò)體內(nèi)circRNA干擾實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有干擾Cia-cGAS后才能明顯影響小鼠體內(nèi)造血干細(xì)胞亞群分布，并表現(xiàn)為L(zhǎng)SK祖細(xì)胞數(shù)量顯著性增加，與此同時(shí)LT-HSC細(xì)胞數(shù)量顯著減少。因此，作者結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及體內(nèi)、體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終錨定Cia-cGAS分子進(jìn)行后續(xù)分子機(jī)制研究。

研究二：環(huán)狀RNA分子細(xì)胞表型

作者發(fā)現(xiàn)Cia-cGAS是由D430042O09Rik (chr7: 125776974–125784712)的4、5、6號(hào)外顯子連接成環(huán)。且位于外顯子上下游的內(nèi)含子區(qū)域具有成環(huán)所需高度同源序列。作者通過(guò)Cas9技術(shù)手段，敲除一端同源序列后，成功獲得Cia-cGAS 敲除小鼠模型。敲除小鼠中LSK祖細(xì)胞顯著增多，LT-HSC顯著減少，且基因敲除小鼠出生6個(gè)月后會(huì)死于貧血。對(duì)基因敲除小鼠中LT-HSC進(jìn)行BrdU染色，結(jié)果說(shuō)明敲除小鼠中LT-HSC細(xì)胞處于增殖分裂活躍期。同時(shí)脈沖標(biāo)記H2B-GFP小鼠模型證實(shí)Cia-cGAS敲除后，靜息狀態(tài)的LT-HSC細(xì)胞比例顯著性降低。

研究三：環(huán)狀RNA分子功能機(jī)制

在確定Cia-cGAS具有明顯細(xì)胞表型之后，作者圍繞其分子機(jī)制展開(kāi)了詳細(xì)的探索。為了找到Cia-cGAS影響下游的靶基因，作者在敲除Cia-cGAS后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因與IFN-α下游靶基因是一致的。且當(dāng)Cia-cGAS敲除后I型IFN mRNAs 表達(dá)量也顯著性增高。最終，作者證實(shí)cia-cGAS通過(guò)調(diào)控I型IFN通路影響LT-HSC靜息狀態(tài)。接下來(lái)，作者針對(duì)Cia-cGAS在該通路中的作用機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)解析。作者直接采用RNA Pull Down技術(shù)手段找到與Cia-cGAS相互作用的功能蛋白。基于這一技術(shù)手段，作者發(fā)現(xiàn)Cia-cGAS與cGAS蛋白具有明顯相互作用。cGAS RIP實(shí)驗(yàn)反向證實(shí)二者之間具有真實(shí)的相互作用。免疫熒光及FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cia-cGAS及cGAS細(xì)胞內(nèi)共定位表達(dá)�；贓MSA等技術(shù)手段，作者找到了二者相互作用位點(diǎn)。后續(xù)作者補(bǔ)充大量生理生化實(shí)驗(yàn)，最終揭示LT-HSC中Cia-cGAS結(jié)合并抑制cGAS的活性，最終通過(guò)拮抗cGAS催化產(chǎn)物I型IFN來(lái)維持HSCs靜息狀態(tài)。

總結(jié)：

本文從環(huán)狀RNA結(jié)合功能蛋白角度，成功的向我們展示了核內(nèi)circRNA具有重要生理功能，以及該類型circRNA的研究方法。首先通過(guò)高通量測(cè)序篩選與造血干細(xì)胞干性維持相關(guān)的circRNA分子，圍繞該分子設(shè)計(jì)一系列體內(nèi)、體外干擾實(shí)驗(yàn)，確定其可引起干細(xì)胞干性維持相關(guān)細(xì)胞表型改變。后續(xù)，與circRNA 海綿機(jī)制研究類似，RNA Pull Down實(shí)驗(yàn)及RIP實(shí)驗(yàn)成為機(jī)制研究成功與否的關(guān)鍵鑰匙。作者基于RNA Pull-down技術(shù)篩選到可能與Cia-cGAS相互作用的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)反向驗(yàn)證。在補(bǔ)充大量生理生化實(shí)驗(yàn)后，作者向我們完整的描繪了Cia-cGAS如何維持HSCs靜息狀態(tài)。本文給我們提供了很好的范本，當(dāng)我們篩選到的環(huán)狀RNA定位于核內(nèi)，或者不能與AGO2蛋白結(jié)合，不適合進(jìn)行海綿機(jī)制研究時(shí)，我們可采取的研究策略。

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作者簡(jiǎn)介：

范祖森，二級(jí)研究員，現(xiàn)任中科院感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，國(guó)科大微免教研室副主任，中國(guó)科學(xué)院特聘核心骨干研究員,國(guó)科大崗位教授（A類）。范祖森1998年獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)博士學(xué)位，隨后到哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院從事博士后研究，于2003年晉升為哈佛大學(xué)講師。2004年作為中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”研究員回到生物物理所工作，2005年獲“杰出青年”基金資助，2006年入選“新世紀(jì)百千萬(wàn)人才工程”國(guó)家級(jí)人才。2010年享受“國(guó)務(wù)院特殊津貼”專家。2014年獲得談家楨生命科學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)，2016年評(píng)為中科院優(yōu)秀研究生導(dǎo)師。課題組長(zhǎng)期從事天然免疫抗感染應(yīng)答調(diào)控、腫瘤干細(xì)胞和腫瘤免疫治療等研究，在天然免疫細(xì)胞新亞群發(fā)現(xiàn)、天然免疫抗感染識(shí)別機(jī)制、腫瘤干細(xì)胞自我更新機(jī)制等方面，取得了一系列有國(guó)際影響力的原創(chuàng)性成果。以第一及通訊作者在Cell（2篇）、Nat Immunol（5篇）、Immunity（2篇）、Cell Stem Cell（2篇）、JEM（3篇）、JCI、NSMB、Nat Commun（8篇）、 EMBO J（2篇）、Blood等國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI高水平研究論文70余篇，研究處于國(guó)際前沿。課題組經(jīng)過(guò)多年的研究積累業(yè)已形成優(yōu)秀的免疫學(xué)研究平臺(tái)和優(yōu)良的科研文化氛圍，在天然免疫抗感染應(yīng)答與腫瘤免疫領(lǐng)域培養(yǎng)出一支優(yōu)秀的科研團(tuán)隊(duì)。已培養(yǎng)了30余位博士畢業(yè)生和近10位博士后，10余人獲得中科院院長(zhǎng)特別獎(jiǎng)、優(yōu)秀獎(jiǎng)及優(yōu)秀博士論文，有近10人晉升為教授崗位（包括北大、清華教授），3人獲得中組部“青年千人”計(jì)劃，1人獲得基金委“優(yōu)青”等。

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