動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒

一、簡 介

    動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（DePure Tissue DNA Kit）適用于動(dòng)物組織、培養(yǎng)細(xì)胞、抗凝血液、體液、分泌液等生物樣品的DNA提取。試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù)，提取過程中無需使用有毒的酚氯仿抽提，也無需進(jìn)行耗時(shí)的醇類沉淀，整個(gè)提取過程只需30分鐘（不含消化時(shí)間）。動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒一次可處理1~20mg組織樣品、1~200µl抗凝血液或體液樣品、5 x 10⁶個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，得到的DNA可直接用于PCR、Southern blot、LAMP、Real-Time PCR等下游實(shí)驗(yàn)。

二、原 理

    動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒基于硅膠柱純化方式。樣品在裂解液(Buffer MTL)和蛋白酶作用下裂解消化，DNA釋放到裂解液中。加入Buffer AL和乙醇后，轉(zhuǎn)移至柱子中過濾，DNA被吸附上柱子的膜上，而蛋白質(zhì)則不被吸附而隨溶液濾出去除。柱子經(jīng)Buffer GW1洗滌蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)，經(jīng)Buffer GW2洗滌去除鹽分，最后DNA被低鹽緩沖液(Buffer AE)洗脫，洗脫的DNA可直接用于PCR、Southern blot、LAMP、Real-Time PCR等下游實(shí)驗(yàn)。

     DePure硅膠柱是采用高結(jié)合力的玻璃纖維濾膜為基質(zhì)。濾膜在高濃度離子化劑(如鹽酸胍或異硫氰酸胍)條件下，可通過氫鍵和靜電等物理作用吸附核酸，而蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)不被吸附而去除。吸附了核酸的濾膜經(jīng)洗滌去除蛋白質(zhì)和鹽，最后可以用低鹽緩沖液(Buffer AE)洗脫出濾膜上吸附的核酸。得到的核酸純度高，可直接用于各種下游實(shí)驗(yàn)。

三、組 成

DePure Tissue DNA Kit

四、保 質(zhì) 期

動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒除Proteinase K外，可在室溫下(15-25℃)干燥保存12個(gè)月。長期保存時(shí)需置于2-8℃。低溫下，Buffer MTL可能會(huì)有沉淀形成，需37℃水浴讓沉淀完全溶解。Proteinase K干粉和RNase Solution室溫運(yùn)輸，收到試劑盒后請保存于2~8℃或-20℃。

五、需 要 準(zhǔn) 備 材 料 和 工 具

• 無水乙醇(96%-100%)
• 滅菌的離心管和吸頭
• 小型離心機(jī)(13,000rpm)
• 水浴鍋或金屬浴
• 按瓶子標(biāo)簽所示，加入適量的Protease Dissolve Buffer至Proteinase K干粉中至終濃度為20mg/ml，顛倒混勻讓蛋白酶K充分溶解，于-20℃保存。

• Buffer GW1使用前，須按瓶子標(biāo)簽所示，加入無水乙醇進(jìn)行稀釋。

• Buffer GW2使用前，須按瓶子標(biāo)簽所示，加入無水乙醇進(jìn)行稀釋。

六、方案1. 動(dòng)物組織DNA提取

    該方案適合于從1~20mg動(dòng)物組織，如肝臟、脾臟、腎臟、老鼠尾巴等組織樣品中提取DNA，以下離心操作都在室溫進(jìn)行。

• 把1~20 mg組織樣品(或10 mg肝臟、肺或脾臟)剪切成盡量小的碎片，并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。加入230µl Buffer MTL和20µl Proteinase K，渦旋混勻。55℃水浴1~3小時(shí)或過夜消化樣品。水浴期間需偶爾渦旋混勻，或放置于振蕩水浴渦中。

注：適當(dāng)?shù)慕M織用量才能獲得理想的提取結(jié)果，樣品過多會(huì)降低產(chǎn)量和純度。脾臟、肝臟、腎臟等組織樣品富含DNA，不宜超過10mg。肌肉和皮膚等樣品用量可用到30mg以提高產(chǎn)量。將組織塊盡量剪切成小碎片可縮短消化時(shí)間。采用液氮研磨，勻漿器處理組織樣品可達(dá)到縮短消化時(shí)間的目的。小鼠尾巴最大用量為1.2cm，大鼠尾巴最大用量為0.6cm。消化時(shí)間取決于樣品的類型和勻漿效果。一般組織樣品需1-3小時(shí)，老鼠尾巴需6-8小時(shí)。過夜消化沒有負(fù)面影響。

• 加入5µl RNase Solution至消化液中混勻。室溫或37℃水浴鍋中放置15~60分鐘降解RNA。

注：RNase Solution消化時(shí)間取決于樣品類型。肝臟和腎臟富含RNA，需較長的消化時(shí)間。

• (可選)10,000rpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5ml離心管中。

注：若消化液比較渾濁或存在明顯的顆粒，不要省略此步。

• 加入250µl Buffer AL至消化液中。最高速度渦旋混勻30秒。70℃水浴10分鐘。
• 加入250µl無水乙醇至消化液中。最高速度渦旋混勻30秒。

注：處理肝臟或脾臟等組織時(shí)，加入乙醇時(shí)會(huì)有沉淀形成，屬正�，F(xiàn)象。用移液槍吸打10-15次盡量打散沉淀團(tuán)。

• 把DePure gDNA Mini Column裝在2ml收集管中。轉(zhuǎn)移第五步獲得的混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000rpm離心1分鐘。

注：若柱子出現(xiàn)堵塞，延長離心時(shí)間。

• 倒棄流出液，把柱子重新裝回收集管中。加入500µl Buffer GW1(已用乙醇稀釋)至柱子上。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW1須用無水乙醇稀釋。按瓶子標(biāo)簽或說明書指示進(jìn)行稀釋。

• 倒棄濾液，把柱子重新裝回收集管中。加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至柱子中。10,000rpm離心1分鐘。

注：Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標(biāo)簽或說明書指示進(jìn)行稀釋。

• 倒棄濾液，把柱子重新裝回收集管中。再加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至柱子中。10,000rpm離心1分鐘。
• 倒棄流出液，把柱子重新裝回收集管中。10,000 × g離心2分鐘去除柱子中殘留的乙醇。
• 將柱子裝在新的1.5ml離心管中。加入30~100µl預(yù)熱至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分鐘。10,000 rpm離心1分鐘。
• (可選)再加入30~100µl預(yù)熱至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分鐘。10,000 × g離心1分鐘。

注: 處理DNA含量很低的樣品無需第二次洗脫。

• 丟棄DNA結(jié)合柱，DNA保存于2-8℃，長期保存需保存于-20℃。

七、方案2. 體液/細(xì)胞DNA提取

    該方案適合于從動(dòng)物血液，血清，血漿，唾液等液體樣品中直接提取DNA，以下離心操作都在室溫進(jìn)行。

• 樣品的處理
  • 紅細(xì)胞帶核的血液樣品：鳥類/魚類等非哺乳類動(dòng)物血液的紅細(xì)胞帶細(xì)胞核，其DNA含量極為豐富。在1.5ml離心管中，加入1-10µl抗凝血液樣品。用Buffer PBS或滅菌水調(diào)整總體積為200 µl，渦旋混勻，按第2步進(jìn)行。
  • 紅細(xì)胞不帶核的血液樣品：在1.5ml離心管中，1-200µl抗凝血液樣品。用Buffer PBS或滅菌水調(diào)整總體積為200 µl，按第2步進(jìn)行。
  • 唾液或其它液體樣品：在1.5ml離心管中，加入1-200µl唾液或其它液體樣品，用Buffer PBS或滅菌水調(diào)整總體積為200 µl，按第2步進(jìn)行。
  • 培養(yǎng)細(xì)胞(5 x 10⁶)：500 rpm離心收集細(xì)胞，倒棄培養(yǎng)液。加入200µl Buffer PBS或滅菌水渦旋重懸細(xì)胞。
• 加入20µl Proteinase K至樣品中，輕輕拍打幾次混勻。
• 加入200µl Buffer AL至樣品中，最高速度渦旋混勻30秒。65℃水浴30分鐘。

注：若需去除RNA，加入5ul RNase A至消化液中，室溫靜置15~30分鐘。

• 加入200µl無水乙醇至消化液中。最高速度渦旋混勻30秒。

注：若加入乙醇后有沉淀形成，用移液槍吸打5次打散沉淀團(tuán)。

• 按方案1的第6~13步進(jìn)行操作。

八、常 見 問 題 解 答

該列表可能有利于您解決在提取過程中所碰到的問題。若您對(duì)試劑盒存在疑問或有良好的建議，又或者您在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中碰到問題，都請您聯(lián)系我們。我們將竭盡所能為您排擾解難。

若以上的解答還是無法解決您的問題，請您聯(lián)系我們。

九、企業(yè)信息

上海一基實(shí)業(yè)有限公司

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