20分文章中的RNA甲基化，熱度與實(shí)力并存

瀏覽次數(shù)：3661　發(fā)布日期：2018-3-9　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

近期華人科學(xué)家辛辛那提大學(xué)陳建軍教授研究了METTL14和m6A RNA甲基化修飾在正常和惡性造血過(guò)程中的重要作用，表明SPI1-METTL14-MYB/MYC信號(hào)軸在髓系分化以及白血病發(fā)生過(guò)程中的作用。該研究于2018年1月發(fā)表在干細(xì)胞頂級(jí)期刊《Cell Steam Cell》（影響因子：23.394）。

研究背景：

每一年，“Nature Methods”都會(huì)對(duì)過(guò)去一年中推動(dòng)生物學(xué)發(fā)展的技術(shù)方法做出總結(jié)，并評(píng)選出當(dāng)年影響力最大的技術(shù)。2016年，表觀轉(zhuǎn)錄組分析（Epitranscriptome analysis）榮膺Nature Methods年度生命科學(xué)技術(shù)。Epitranscriptome廣義的指添加到核糖核苷酸上的一切修飾，并引起機(jī)體相關(guān)表型變化的現(xiàn)象。其中，RNA甲基化研究是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)一面大旗，在世界引起了新的科研熱潮。N6-甲基腺苷（m6A）是真核細(xì)胞信使RNA（messenger RNAs，mRNA）最常見(jiàn)的內(nèi)部修飾方式。許多證據(jù)表明mRNA或者非編碼RNA上的m6A修飾影響RNA的命運(yùn)以及功能，并且在組織發(fā)育，晝夜節(jié)律，DNA損傷應(yīng)答，性別決定和腫瘤發(fā)生等生理過(guò)程中都發(fā)揮重要的作用。然而，它在正�；蛘邜盒栽煅^(guò)程中的功能依然不清楚，本文針對(duì)該方向展開(kāi)系統(tǒng)的研究。

研究思路：

RNA甲基化修飾伴隨系統(tǒng)酶系協(xié)同作用，其中包括“Writer”-負(fù)責(zé)甲基轉(zhuǎn)移過(guò)程，“Eraser”-負(fù)責(zé)去甲基化過(guò)程，“Reader”-負(fù)責(zé)甲基化位點(diǎn)識(shí)別。RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶以復(fù)合物形式存在，這個(gè)復(fù)合物由METTL3/METTL14異二聚體催化核心和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基WTAP組成。 METTL3具有活化的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，能夠催化腺苷酸（A）為m6A，METTL14特異性促進(jìn)METTL3識(shí)別RNA底物�？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)METTL14作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的重要組成部分，在正常造血干/祖細(xì)胞以及攜帶有t（11q23），t（15；17）或者t（8；21）急性髓系白血病細(xì)胞中有較高的表達(dá)水平，并且它在髓系分化過(guò)程中表達(dá)下調(diào)。沉默METTL14能夠促進(jìn)正常的HSPC和AML細(xì)胞終末髓系分化，并且能夠抑制AML細(xì)胞的存活/增殖。在機(jī)制上，METTL14通過(guò)m6A修飾調(diào)節(jié)其靶基因（如：MYB，MYC）發(fā)揮致癌作用，并在蛋白質(zhì)水平受SPI1的負(fù)調(diào)控。METTL14在AML疾病以及白血病干/起始細(xì)胞（leukemia stem / initiation cells， LSCs/LICs）的發(fā)展以及維持過(guò)程中必不可少。總之，該研究揭示了SPI1-METTL14-MYB / MYC信號(hào)軸在髓細(xì)胞和白血病中的作用，并強(qiáng)調(diào)了METTL14調(diào)控m6A修飾在正常和惡性造血中的關(guān)鍵作用。

研究一：METTL14在HSPC中高表達(dá)，隨正常髓細(xì)胞生成下調(diào)

作者首先檢測(cè)了不同小鼠骨髓細(xì)胞（BMCs）中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶及去甲基化酶的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)c-Kit-型小鼠Mettl14及Fto表達(dá)量顯著性下調(diào)。同時(shí)，c-Kit-型小鼠mRNA修飾水平也存在顯著性下降現(xiàn)象。進(jìn)一步檢測(cè)HSCs和祖細(xì)胞中的Mett14表達(dá)量，結(jié)果顯示Mettl14在HSCs和Lin-Sca-1 + c-kit+ （LSK）細(xì)胞中高水平表達(dá)。確定Mettl14在定型或分化的骨髓譜系細(xì)胞中表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)后，作者進(jìn)行細(xì)胞表型相關(guān)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Mettl14細(xì)胞功能。通過(guò)Mettl14干擾等實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)隨著Mettl14在髓細(xì)胞生成過(guò)程中下調(diào)表達(dá)，其敲低進(jìn)一步顯著促進(jìn)了HSPC向髓樣細(xì)胞的分化，這意味著METTL14在抑制正常骨髓生成中起重要作用。作者后續(xù)發(fā)現(xiàn)Mettl14在急性髓性白血病細(xì)胞（AMLs）中有同樣的表達(dá)模式。

圖示：Mettl14骨髓譜系細(xì)胞中差異表達(dá)，Mettl14敲降抑制骨髓生成過(guò)程

研究二：METTL14表達(dá)受SPI1負(fù)調(diào)控

在了解METTL14在骨髓生成過(guò)程中特異表達(dá)后，作者研究了其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。通過(guò)ChIP-Seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)造血調(diào)控因子，CEBPB, GABPA, ELF1, CEBPA以及 SPI1與METTL14上游啟動(dòng)子區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)。其中除SPI1是負(fù)調(diào)控外，其它因子都呈現(xiàn)正調(diào)控作用。敲除SPI1后，無(wú)論AMLs或CD34+ HSPCs中METTL14 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均上調(diào)。通過(guò)ChIP-qPCR驗(yàn)證SPI1與METTL14 啟動(dòng)子區(qū)有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，SPI1是METTL14負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。

圖示：AMLs及CD34+ HSPCs中，SPI1對(duì)METTL14負(fù)調(diào)節(jié)作用

研究三：RNA-Seq結(jié)合m6A-Seq

尋找METTL14生理底物作者結(jié)合RNA-Seq以及m6A-Seq在MM6及NB4細(xì)胞（不同AMLs）中尋找METTL14生理底物。RNA-seq顯示在兩個(gè)細(xì)胞系中，METTL14敲低時(shí)560個(gè)基因顯著下調(diào)，而377個(gè)基因顯著上調(diào)（p <0.05;倍數(shù)變化> 1.2）�；蚣患治觯℅SEA）顯示相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，造血/白血病干細(xì)胞中下調(diào)的基因主要富集MYB下調(diào)靶基因。MM6和NB4細(xì)胞m6A-seq結(jié)果中鑒定出16,675和18,831個(gè)m6A峰，其對(duì)應(yīng)于8,246和9,632個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。與前期研究一致，m6A峰常規(guī)Motif為GGAC序列，且甲基化峰主要位于基因啟動(dòng)子區(qū)域。作者結(jié)合miCLIP證實(shí)，METTL14敲低時(shí)mRNA甲基化的變化主要由內(nèi)部m6A，而不是5'Cap m6Am導(dǎo)致。

圖示：RNA-Seq及m6A-Seq數(shù)據(jù)展示，METTL14直接作用MYB及MYC基因

研究四：MYB及MYC為METTL14靶基因

分析m6A-seq及m6A-qPCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在METTL14敲低時(shí)，MYB和MYC的m6A修飾豐度顯著降低。CLIP實(shí)驗(yàn)直接證實(shí)METTL14直接結(jié)合MYC及MYB轉(zhuǎn)錄本。并且METTL14敲除AML細(xì)胞系中，MYB及MYC的表達(dá)量顯著下調(diào)控。除人源細(xì)胞系，作者還發(fā)現(xiàn)Mettl14敲除小鼠C-Kit+ HSPC中MYB及MYC轉(zhuǎn)錄本上m6A修飾減少，并且兩種基因表達(dá)量均下降。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，METTL14主要通過(guò)調(diào)控MYB及MYC甲基化水平，進(jìn)而調(diào)控二者的表達(dá)水平。