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2018國自然研究熱點(diǎn)二： RNA甲基化研究深度剖析

瀏覽次數(shù)：3743　發(fā)布日期：2018-3-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、聽說最近 RNA甲基化很火，它是何方神圣？

1、高分文章頻現(xiàn)

說起近來的科研熱點(diǎn)，RNA甲基化修飾的相關(guān)研究可以說是當(dāng)前整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域最熱門的方向之一，亮點(diǎn)文章頻出，著實(shí)讓人有些目不暇接。RNA甲基化的研究近3月發(fā)表的文章影響因子為10分以上的，就有高達(dá) 17 篇。

圖：RNA甲基化近期高分文章一窺

2、文章數(shù)屢攀新高

日益增多的發(fā)表文章、特別是高分文章說明，這個(gè)領(lǐng)域現(xiàn)在正在迅速成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。而就歷年發(fā)表情況來看，RNA甲基化領(lǐng)域的增長勢(shì)頭也十分喜人，僅2018年1月已發(fā)表文獻(xiàn)就達(dá)到了25篇。

圖：RNA甲基化歷年發(fā)文章數(shù)據(jù)

3、國自然立項(xiàng)數(shù)漲勢(shì)喜人

縱向?qū)Ρ葰v年立項(xiàng)數(shù)，我們可以發(fā)現(xiàn)，RNA甲基化這兩年的基金項(xiàng)目呈指數(shù)級(jí)增長的趨勢(shì)：特別是從2015年的5項(xiàng)到2017年的25項(xiàng)，項(xiàng)目增長尤為顯著。

圖： RNA甲基化歷年國自然立項(xiàng)情況

由上圖可知，2017年國家自然科學(xué)金獲批的項(xiàng)目中，RNA甲基化研究相關(guān)的項(xiàng)目總數(shù)為25項(xiàng)。從獲批的項(xiàng)目的研究內(nèi)容來看，既有單純鑒定RNA甲基化譜的課題，也有從RNA甲基化修飾酶入手的課題，以及針對(duì)RNA甲基化的功能機(jī)制展開的課題。這表明RNA甲基化的研究還是處于一個(gè)基礎(chǔ)篩選與功能機(jī)制齊飛，比較多樣化的狀態(tài)。值得一提的是，也有課題將RNA甲基化修飾與miRNA以及外泌體分泌聯(lián)系起來，以篩選/鑒定腫瘤分子標(biāo)志物，這也是一個(gè)值得嘗試的RNA甲基化重要方向。

咱們舉例來看一下2017年的具體立項(xiàng)情況，我們也可以看出，除了鑒定RNA甲基化相關(guān)酶的切入點(diǎn)，RNA甲基化課題涵蓋范圍極其廣泛，包括了：疾病發(fā)生發(fā)展、水稻生殖發(fā)育、果蠅性別決定等諸多重要領(lǐng)域。

圖： RNA甲基化修飾2017國自然立項(xiàng)列舉

二、聽說有3種RNA甲基化修飾大熱，他們是誰？

RNA甲基化修飾類型很多，目前最熱門的有三種，分別是：m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化。

圖： 3種熱門RNA甲基化修飾

1、m6A RNA甲基化是最常見、最豐富的真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾，現(xiàn)在的研究主要是圍繞各修飾的關(guān)鍵酶展開。何川教授在2017年1月的Nature Review（IF=46.602）上總結(jié)過m6A的相關(guān)修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（METTL3、METTL14和WTAP組成）、去甲基酶（FTO和ALKBH5）以及相應(yīng)的閱讀器（YTHDF1/2/3，YTHDC1）協(xié)同調(diào)控。相關(guān)功能的研究證明了m6A修飾是動(dòng)態(tài)可逆的，而且具有種類多樣而又廣泛的重要生物學(xué)意義。已發(fā)現(xiàn)的m6A RNA甲基化功能有很多，比如它可以促進(jìn)環(huán)狀RNA翻譯(2017.3 Cell Res, IF 14.812)，或者通過促進(jìn)mRNA降解來調(diào)控癌癥干細(xì)胞的分化(2016.4 Cell Host Microbe, IF9.661)，還能調(diào)控T細(xì)胞分化及免疫穩(wěn)態(tài)(2017.8 Nature. IF 40.137)。

圖： m6A RNA甲基化動(dòng)態(tài)可逆修飾

2、m5C RNA甲基化是近年來發(fā)現(xiàn)一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測(cè)序手段驗(yàn)證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C廣泛存在，但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統(tǒng)性報(bào)道。對(duì)于m5C來說，也有一系列的相關(guān)修飾酶(如下圖)。m5C RNA甲基化功能，目前發(fā)現(xiàn)他可以調(diào)控mRNA出核(2017 Cell Res, IF 14.812)，或者調(diào)控干細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(2017 Nature, IF 40.137)。

圖： m5C RNA甲基化動(dòng)態(tài)可逆修飾

3、m1A RNA甲基化是一個(gè)新進(jìn)入大家的視野的RNA甲基化修飾類型。最近發(fā)表在Molecular Cell （IF：14.714）上的一篇關(guān)于m1A RNA甲基化的文章介紹到這是一類新型RNA修飾，它普遍存在于非編碼RNA和mRNA中。m1A RNA甲基化功能，目前發(fā)現(xiàn)tRNA上發(fā)生多種m1A修飾(2017.2 Nucleic Acids Research， IF 9.28)，或者參與調(diào)控翻譯起始和延伸(2016 Cell，IF 30.41)。總之，RNA甲基化也是調(diào)控基因表達(dá)的一種重要途徑。

圖：m1A RNA甲基化動(dòng)態(tài)可逆修飾

三、RNA甲基化相關(guān)的酶有哪些？

RNA甲基化修飾相關(guān)蛋白包含特定甲基化修飾特有的甲基轉(zhuǎn)移酶（Writer）、去甲基酶（Reader）以及相應(yīng)的RNA甲基化識(shí)別蛋白（Reader）協(xié)同調(diào)控，以維持特定類型甲基化的動(dòng)態(tài)修飾。許多高分文章都是針對(duì)甲基化修飾蛋白來進(jìn)行功能機(jī)制研究。那么至今為止，不同的甲基化修飾的關(guān)鍵修飾蛋白都有哪些呢？經(jīng)過翻閱文獻(xiàn)查找，小編幫大家總結(jié)了一下目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的相關(guān)修飾蛋白，方便大家參考：

圖： RNA甲基化修飾相關(guān)酶整理

四、RNA甲基化這么火，它的研究思路是怎樣的呢？

RNA甲基化目前的研究思路由淺及深，也是有兩大類：1、RNA甲基化譜2、功能機(jī)制研究。那么且讓咱們分門別類、細(xì)細(xì)道來！

1、RNA甲基化譜

由于RNA甲基化領(lǐng)域非常新，絕大部分物種、組織和疾病中的RNA甲基化分布圖譜尚未報(bào)道。對(duì)于想要短平快的發(fā)表文章的老師來說，RNA甲基化譜分析是非常合適的。

一篇RNA甲基化譜的文章是怎么煉成的？研究伊始，我們要確定好研究目標(biāo)：物種，疾病模型，樣品類型、盡可能詳盡的樣品信息。接下來，通過RNA甲基化測(cè)序高通量地篩選RNA甲基化區(qū)域或位點(diǎn)，并進(jìn)行深入的生物信息挖掘，例如：甲基化位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)﹑基因組分布﹑甲基化基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)（GO、Pathway分析）等等。

圖： RNA甲基化表達(dá)譜思路圖

咱們就以一篇影響因子11分的典型的RNA甲基化譜文章為例，來了解一下吧。這篇文章發(fā)表在Genome Biology上，展示了小鼠胚胎干細(xì)胞及大腦中的m5C RNA修飾整體狀況。

圖： m5C RNA甲基化位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

首先通過 Bis-seq技術(shù)對(duì)不同樣本中總poly（A）RNA和核poly（A）RNA的 m5C位點(diǎn)共分析和特異性分析。

圖： qPCR驗(yàn)證m5C RNA甲基化測(cè)序結(jié)果

隨后用qPCR驗(yàn)證m5C修飾位點(diǎn)，從圖上可以看到16個(gè)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄本中13個(gè)都顯著富集。接著對(duì)m5C RNA甲基化測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ESC總poly（A）RNA中特異的m5C甲基化修飾是由于甲基化程度的差異造成的，而與由不同樣本間基因差異表達(dá)無關(guān)。并對(duì)m5C修飾的RNA對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，顯示小鼠腦組織及小鼠胚胎干細(xì)胞間共有和特有的前十條GO條目。

圖：不同樣本的m5C位點(diǎn)分布規(guī)律

進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析顯示，不同樣本的總poly（A）RNA中m5C位點(diǎn)一致的分布規(guī)律：小鼠胚胎干細(xì)胞中m5C修飾位點(diǎn)優(yōu)先分布于mRNA起始密碼子附近，在小鼠腦組織中則傾向于分布在3’UTR區(qū)。

圖： CLIPdb : m5C位點(diǎn)與RBPs結(jié)合位點(diǎn)的共分析

通過與CLIPdb的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎干細(xì)胞中大約29%的poly（A）m5C RNA修飾位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)RBP（RNA結(jié)合蛋白）結(jié)合位點(diǎn)重合，這一百分?jǐn)?shù)在小鼠腦組織中大約為11%，顯示出與RBP結(jié)合并在特定轉(zhuǎn)錄本中發(fā)揮生物學(xué)功能的潛力。

到這里這樣一篇m5C RNA修飾表達(dá)譜的文章就結(jié)束了，可以看出幾乎沒有涉及到實(shí)驗(yàn)操作，僅僅是針對(duì)m5C RNA甲基化測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行詳盡的展示和分析。亮點(diǎn)是還聯(lián)合CLIPdp的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)了一下m5C RNA甲基化位點(diǎn)作為RBP靶點(diǎn)的潛力。值得我們借鑒。

2、功能機(jī)制研究

看完了表達(dá)譜，那么RNA甲基化的功能機(jī)制要如何研究？咱們就以一篇影響因子27分的Cancer Cell文章為例，來了解一下吧。這是一篇來自于美國安德森癌癥中心黃素云課題組與芝加哥大學(xué)何川課題組合作的課題，揭示了m6A RNA甲基化在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用。

首先放一下技術(shù)路線圖。

圖：展示的文章功能集中技術(shù)路線圖

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示GSC中m6A去甲基化酶ALKBH5的表達(dá)水平明顯升高。對(duì)不同病人的預(yù)后檢測(cè)，生存曲線發(fā)現(xiàn)ALKBH5高表達(dá)的病人預(yù)后更差。

圖：ALKBH5與較差的臨床預(yù)后相關(guān)

作者通過MeRIP-Seq技術(shù)鑒定m6A RNA甲基化修飾圖譜，聯(lián)合表達(dá)譜檢測(cè)差異表達(dá)>2倍的基因。最終篩選到與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的ALKBH5靶基因－FOXM1，其在GSCs的自我修復(fù)和腫瘤形成中起到關(guān)鍵作用。

圖： ALKBH5作用靶基因——FOXM1篩選流程圖

通過MeRIP qPCR發(fā)現(xiàn)敲低ALKBH5可增加FOXM1前體mRNA的m6A甲基化水平。這些結(jié)果表明ALKBH5主要通過去甲基化活性影響FOXM1的表達(dá)。

圖：敲低ALKBH5上調(diào)FOXM1的前體mRNA表達(dá)及m6A RNA修飾

通過RIP、RNA pull down實(shí)驗(yàn)表明FOXM1-AS可與ALKBH5和FOXM1前體mRNA直接結(jié)合。

圖：RIP和RNA Pull down實(shí)驗(yàn)證明ALKBH5和FOXM1-AS 直接結(jié)合

最后，作者進(jìn)一步研究了FOXM1-AS對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，結(jié)果表明FOXM1-AS可正調(diào)控FOXM1的表達(dá)，并可維持惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞性能。而外源性的FOXM1可顯著逆轉(zhuǎn)敲低ALKBH5引起的抑制作用。

五、RNA甲基化研究常用技術(shù)

1、云序生物MeRIP-Seq

適用范圍：m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化；

技術(shù)原理：用特異性抗體富集甲基化RNA后再對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)；

目前對(duì)RNA甲基化最流行的檢測(cè)手段為MeRIP-Seq技術(shù)，該技術(shù)將甲基化RNA免疫共沉淀和RNA測(cè)序技術(shù)組合起來，高精度地檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的RNA甲基化修飾。具體原理如下：將針對(duì)特定RNA甲基化修飾的抗體與RNA樣品共孵育（IP），抓取有甲基化修飾的RNA片段進(jìn)行測(cè)序；同時(shí)需要平行測(cè)序一個(gè)對(duì)照（Input）樣本，用于消除非特異性抓取甲基化片段的背景。對(duì)比免疫共沉淀樣本(IP)和對(duì)照樣本（Input）中的序列片段，將RNA甲基化修飾位區(qū)域定位到轉(zhuǎn)錄組上，并計(jì)算樣本中RNA甲基化程度。云序生物具有全面的m6A﹑m5C﹑m1A甲基化MeRIP-Seq產(chǎn)品線，能夠?qū)ircRNA，LncRNA，mRNA中的各類RNA甲基化修飾進(jìn)行全面的檢測(cè)。

圖：云序生物MeRIP-seq實(shí)驗(yàn)流程

2、云序生物Bis-Seq
適用范圍：m5C RNA甲基化；

技術(shù)原理：對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)；

針對(duì)m5C RNA甲基化的修飾還有一種單堿基分辨的檢測(cè)手段：用重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理樣品。重亞硫酸鹽處理能夠?qū)⒒蚪M中未發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)換成U，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后變成T，這樣反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物就會(huì)出現(xiàn)單點(diǎn)突變，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，通過與不處理組進(jìn)行序列比對(duì)，就可以很容易的找出m5C修飾的位點(diǎn)。云序生物具有成熟的Bis-seq實(shí)驗(yàn)平臺(tái)以及豐富的RNA甲基化測(cè)序經(jīng)驗(yàn)，可以滿足客戶對(duì)不同樣本、不同類型RNA甲基化測(cè)序的各類需求。

圖：云序生物m5C Bis-Seq 實(shí)驗(yàn)流程

3、云序生物RIP 和 RNA Pull down

當(dāng)測(cè)序、篩選和驗(yàn)證工作結(jié)束后，想要發(fā)表高分文章，那么功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行往往還少不了兩個(gè)好幫手：RIP和RNA pull down實(shí)驗(yàn)，主要用來證實(shí)候選靶基因與甲基化相關(guān)蛋白的直接結(jié)合，是解析RNA甲基化調(diào)控機(jī)制的利器。就像上面舉例的CancerCell一文里，作者通過RIP、RNA pull down實(shí)驗(yàn)來證明受RNA甲基化調(diào)控的靶基因可與去甲基化酶ALKBH5直接結(jié)合。

那么RIP和RNA pull down是什么呢？

①RIP（RNA Immunoprecipitation）是RNA免疫共沉淀技術(shù).利用抗體特異性結(jié)合目的蛋白,進(jìn)而檢測(cè)與該蛋白結(jié)合的RNA分子，用于檢測(cè)特定蛋白質(zhì)與RNA的相互作用。RIP-Seq結(jié)合RIP技術(shù)和高通量測(cè)序，能夠高通量地檢測(cè)與特定蛋白結(jié)合的RNA，從而解析全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的目標(biāo)蛋白-RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。RIP-qPCR則可以檢測(cè)特定蛋白上結(jié)合的RNA分子。例如可以通過RIP-qPCR檢測(cè)甲基化修飾相關(guān)酶是否與某RNA分子結(jié)合。

②RNA Pull down是利用特定探針把目的RNA拉下來，進(jìn)而檢測(cè)與之結(jié)合的RNA或蛋白質(zhì)。用于檢測(cè)特定RNA與蛋白質(zhì)/RNA的相互作用。RNA Pull down后接Western Blot可以檢測(cè)特定的RNA是否與特定的RNA結(jié)合蛋白相互作用。RNA Pull down后接質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)則可以解析蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)的所有蛋白信息。

圖：云序生物RIP-seq及RNA Pull down實(shí)驗(yàn)流程

六、RNA甲基化項(xiàng)目國自然申請(qǐng)建議

1、RNA甲基化研究目前處于上升期，可以嘗試設(shè)計(jì)特定細(xì)胞、組織類型表達(dá)譜的研究內(nèi)容。盡早進(jìn)行表達(dá)譜分析，找到研究價(jià)值高的的差異修飾分子，豐富功能預(yù)測(cè)信息，并開展一些簡(jiǎn)單的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，最好能形成大致的功能機(jī)制研究的輪廓。也可以嘗試和其他科研熱點(diǎn)相結(jié)合，比如外泌體中m6A修飾的miRNA表達(dá)譜。

2、結(jié)合特定RNA甲基化修飾類型的修飾酶，開展功能機(jī)制研究。機(jī)制研究方向上，靈活運(yùn)用利用多種有效地分析RNA分子與其他分子或蛋白相互作用的研究工具。包括RIP，RNA pull-down等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如果能得到有效數(shù)據(jù)，會(huì)在國自然科學(xué)基金申請(qǐng)中增色不少。

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