單細(xì)胞測(cè)序研究一直是當(dāng)今的熱門(mén)話(huà)題，想知道單細(xì)胞技術(shù)有哪些重要的應(yīng)用？想深入了解當(dāng)今主流的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)嗎？華大智造《單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)講堂》開(kāi)講啦！跟著小造一起尋找這些問(wèn)題的答案。

單細(xì)胞測(cè)序的重要性

隨著第二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS) 技術(shù)和第三代測(cè)序( third generation sequencing，TGS)技術(shù)的飛速發(fā)展，引起生物研究領(lǐng)域的巨大變革。以前，需要從大量細(xì)胞中獲取足夠多的DNA 進(jìn)行測(cè)序，因此測(cè)序結(jié)果是這些細(xì)胞“整體”的表征。然而，由于細(xì)胞異質(zhì)性，相同表型的細(xì)胞的遺傳信息可能存在顯著性差異，很多低豐度的信息會(huì)在整體表征中丟失。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)高通量測(cè)序的局限性，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是指在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)。它能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)［1］。2013年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被Nature Methods評(píng)為年度技術(shù)（圖1左）。同年，《科學(xué)》雜志（Science）將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首，認(rèn)為該技術(shù)將改變生物界和醫(yī)學(xué)界的許多領(lǐng)域。由于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)廣闊的應(yīng)用前景，2015年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)再度登上Science 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)封面（圖1右）。

圖1.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)榮登頂尖雜志年度封面
(圖片來(lái)源http://t.cn/R840r7W；http://t.cn/RQHjnW3)

2017年10月16日，與“人類(lèi)基因組計(jì)劃”相媲美的“人類(lèi)細(xì)胞圖譜計(jì)劃”（圖2） 首批擬資助的38個(gè)項(xiàng)目正式公布。人類(lèi)細(xì)胞圖譜計(jì)劃是一項(xiàng)大型國(guó)際合作項(xiàng)目：根據(jù)獨(dú)特的分子信息（如基因表達(dá)）對(duì)所有人類(lèi)細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行定義，并將這些信息與傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)表述（如位置和形態(tài)）相關(guān)聯(lián)。其中一項(xiàng)關(guān)鍵的技術(shù)就是單細(xì)胞測(cè)序。

圖2: 人類(lèi)細(xì)胞圖譜計(jì)劃
（圖片來(lái)源: http://t.cn/RQHYNxw）

相信未來(lái)單細(xì)胞技術(shù)，將會(huì)大大改變?nèi)祟?lèi)的科學(xué)研究以及臨床應(yīng)用，尤其是在腫瘤、微生物、神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域。下面我們將重點(diǎn)介紹近年來(lái)單細(xì)胞技術(shù)在以上領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)。

單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用

1 在腫瘤研究中的應(yīng)用

2012年3月2日，深圳華大基因研究院在腫瘤研究上獲得突破性進(jìn)展，于國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》（Cell）上同時(shí)發(fā)表兩篇研究論文［2，3］。該工作研發(fā)了一種解析單細(xì)胞基因組的新方法，并將該方法應(yīng)用于原發(fā)性血小板增多癥（一種血癌）和腎透明細(xì)胞癌（一種腎癌）（圖4）的腫瘤內(nèi)部遺傳特征研究。此新方法解決了之前無(wú)法解決的腫瘤高異質(zhì)性難題，為深入研究癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開(kāi)辟了新的研究方向。

圖3.華大單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分別應(yīng)用于血癌和腎癌研究

2016年，麻省總醫(yī)院MGH、Broad研究所的研究人員在單細(xì)胞水平上對(duì)腦瘤進(jìn)行基因組分析，首次在人類(lèi)腦瘤樣本中鑒定到了癌癥干細(xì)胞及其分化后代 [4]。研究人員分析了六個(gè)早期少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的四千多個(gè)腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在發(fā)育上可以分為三類(lèi)。其中一類(lèi)比較像神經(jīng)干細(xì)胞，另外兩類(lèi)具有一定的分化特征。研究結(jié)果證實(shí)了癌癥干細(xì)胞是少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的主要生長(zhǎng)源，這些細(xì)胞將成為很有前景的治療靶標(biāo)。

圖4:在單細(xì)胞水平上對(duì)腦瘤進(jìn)行基因組分析

2 在微生物研究中的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序在微生物領(lǐng)域也取得了重要突破。2017年，來(lái)自美國(guó)UCSF的研究組首次實(shí)現(xiàn)原核生物的微生物單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)［5］。圖5展示了該研究的詳細(xì)流程。

圖5：基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)微生物單細(xì)胞測(cè)序

3 在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)幫助科學(xué)家更深入的了解大腦神經(jīng)細(xì)胞。2017年，Salk生物研究所領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)根據(jù)甲基化和調(diào)控特征，區(qū)分小鼠和人類(lèi)大腦樣本中的神經(jīng)元亞型，并鑒定出人類(lèi)額葉皮質(zhì)中一組新的神經(jīng)元[6]。研究人員利用單細(xì)胞甲基化測(cè)序分析小鼠和人類(lèi)額葉皮質(zhì)樣本中近6200個(gè)神經(jīng)元，并根據(jù)甲基化和調(diào)控元件特征對(duì)已知的神經(jīng)元亞型進(jìn)行聚類(lèi)。此外，他們還指出人類(lèi)大腦中存在一種新的神經(jīng)元亞型，稱(chēng)為“第6層興奮性神經(jīng)元”，它們有著獨(dú)特的甲基化標(biāo)記。

這篇論文的通訊作者之一、Salk研究所的計(jì)算神經(jīng)生物學(xué)研究人員Margarita Behrens表示：“我們的研究表明，我們能夠根據(jù)神經(jīng)元的甲基化組來(lái)清晰定義神經(jīng)元類(lèi)型。這有助于我們了解同一區(qū)域、外表相似的兩種神經(jīng)元為何表現(xiàn)不同。”

圖6: 通過(guò)高通量單細(xì)胞甲基化測(cè)序得到小鼠和人額葉皮層神經(jīng)元細(xì)胞的亞型

2018年初，張鹍教授團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology上發(fā)表了一個(gè)基于全新單細(xì)胞核測(cè)序方法的成年人腦第二代單細(xì)胞圖譜[7]。該研究通過(guò)結(jié)合基于微流體的單核測(cè)序（snDrop-seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座體超敏性位點(diǎn)測(cè)序（scTHS-seq）的方法，不僅能利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定不同功能的細(xì)胞類(lèi)型，還能通過(guò)表觀遺傳學(xué)特征更好描述這些表達(dá)圖譜是如何調(diào)節(jié)或者維持的。該研究檢測(cè)了超過(guò)60，000個(gè)來(lái)自成人大腦皮層和小腦的單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了35種不同的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型。并且發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞中哪些亞型更易受到不同腦部疾病常見(jiàn)危險(xiǎn)因素的影響。

圖7:成人大腦不同區(qū)域細(xì)胞類(lèi)型的多樣性

4 在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

由于傳統(tǒng)的免疫細(xì)胞分析方法，取樣來(lái)自一大堆細(xì)胞，低估了單個(gè)免疫細(xì)胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測(cè)單個(gè)免疫細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，從而理解機(jī)體復(fù)雜的免疫機(jī)制。

2017年，Ido Amit團(tuán)隊(duì)在大腦中發(fā)現(xiàn)一種新型免疫細(xì)胞——disease-associated microglia（DAM）[8]，證實(shí)DAM細(xì)胞負(fù)責(zé)降解死亡的細(xì)胞以及與阿爾茲海默癥相關(guān)聯(lián)的蛋白病斑。研究人員強(qiáng)調(diào)，只有對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序才能發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)的小膠質(zhì)細(xì)胞，從而為治療包括阿爾茲海默癥等在內(nèi)的神經(jīng)類(lèi)疾病提供新方法。

圖8. 單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)新型免疫細(xì)胞

2017年，來(lái)自Broad研究所等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們借助單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)在人類(lèi)免疫系統(tǒng)中鑒定出了新型細(xì)胞[9]。他們通過(guò)對(duì)健康獻(xiàn)血者分離獲得的約2400個(gè)單細(xì)胞RNA進(jìn)行了測(cè)序，并富集HLA-DR+細(xì)胞系，嘗試 對(duì)DC細(xì)胞和單核細(xì)胞的分類(lèi)進(jìn)行重新鑒定和修訂。這一成果是人類(lèi)細(xì)胞圖譜（Human Cell Atlas）計(jì)劃的首批重要發(fā)現(xiàn)之一。該計(jì)劃旨在描述人體內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞，以期加速生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將徹底改變醫(yī)生和研究人員如何理解、診斷和治療疾病。

圖9.人類(lèi)血液中樹(shù)突細(xì)胞和單核細(xì)胞圖譜

結(jié)語(yǔ)

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)從誕生至今，僅僅短短數(shù)年的時(shí)間，便取得了飛速的發(fā)展以及矚目的成果。2009年、2010年，在頂級(jí)期刊發(fā)表的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)類(lèi)文章數(shù)均僅有3篇。而到2013年、2014年該數(shù)目分別為23及27篇。現(xiàn)在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)越來(lái)越受到科研工作者及臨床工作者的青睞，每年有越來(lái)越多的重要成果發(fā)表在頂級(jí)期刊上。

而華大基因，在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域也取得了重大突破。2012-2017年，在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域華大基因一共發(fā)表了15篇文章，影響因子最高44，累計(jì)影響因子高達(dá)189。下面圖表是華大基因在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域的代表性文章：

表1.華大單細(xì)胞測(cè)序高分文章列表

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下期我們將會(huì)與大家一起分享單細(xì)胞講堂第二講《單細(xì)胞分離技術(shù)》，敬請(qǐng)期待！

參考文獻(xiàn)

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