特異性抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能測定

實(shí)驗(yàn)試劑

（Sigma）：用培養(yǎng)液或PBS配制300μg/ml

含20%的新生牛血清的RPMI 1640

實(shí)驗(yàn)材料

EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)步驟

1.   特異性CTL的誘導(dǎo)和制備

1)   取作者外周血分離PBMC，無血清1640洗兩遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640調(diào)成1.5×10⁶ /ml，置于24孔板中，于5% CO₂ 培養(yǎng)箱中4小時(shí)使單核細(xì)胞貼壁以去除之，然后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)；

2)   取EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞，加入，最終濃度為30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀細(xì)胞用1640液洗滌3次并計(jì)數(shù)；

3)   取2×10⁶ 個(gè)PBL于24孔板中，加入5×10⁴ （2.5%）個(gè)經(jīng)處理（30mg/ml、30min）的自身、同種異體（其HLA-I類型別完全不同）的EBV-LCL細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，混勻，用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640）補(bǔ)總體積至2ml；

4)   靜置于培養(yǎng)箱中；4d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3d；

5)   離心收集細(xì)胞，取1×10⁶ 個(gè)反應(yīng)細(xì)胞，加入2×10⁵個(gè)（20%）的刺激細(xì)胞，第三天加入重組IL-2，使終濃度為30U/ml；每三天半量換液一次并維持相同IL-2濃度。

6)   每周按相同程序刺激效應(yīng)細(xì)胞一次，3~4次后，效應(yīng)細(xì)胞即為特異性CTL，可用于殺傷實(shí)驗(yàn)。

2.   細(xì)胞毒試驗(yàn)

檢測CTL細(xì)胞毒作用均可采用檢測NK細(xì)胞殺傷活性的方法，僅效靶細(xì)胞比例不一樣，現(xiàn)將LDH釋放法簡要敘述如下：

1)   靶細(xì)胞為用作刺激細(xì)胞的自身或同種異體EBV-LCL細(xì)胞，調(diào)成1×10⁵/ml；

2)   效應(yīng)細(xì)胞為上述誘導(dǎo)的特異性CTL，調(diào)成2.5×10⁶/ml；

3)   各取0.1ml于96孔板中（效/靶比值為25:1）；輕輕吹打，使二者混勻；同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對照組（即只加靶細(xì)胞而不加效應(yīng)細(xì)胞）和最大釋放對照組（0.1ml靶細(xì)胞和0.1ml 1% NP-40）；

4)   1000rpm/min離心2min后，置37°C、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育4hr;

5)   酶促顯色反應(yīng)：參見“NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)”。