流式細(xì)胞儀的使用程序

一．開機(jī)程序

1． 檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定 5 分鐘。

2． 打開儲液箱，倒掉廢液, 并在廢液桶中加入 400ml 漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至 4/5 滿（一般可用三蒸水，做分選必須用 PBS 或 FACSFlow），合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

3． 將 FACSCalibur 開關(guān)打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY，預(yù)熱 5－10 分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。

4． 如果需要打印，打開打印機(jī)電源。

5． 打開電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋果標(biāo)志。

6． 執(zhí)行儀器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的氣泡。

7． 分析樣品時，先用 FACAFlow 或 PBS 進(jìn)行 HIGH RUN 約 2 分鐘。

注：做過分選后，每次開機(jī)后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個 50ml 離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。

二．預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)

1． 從蘋果標(biāo)志中選擇 CELLQuest 見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。

2． 選取屏幕左列繪圖工具中的 Dot plot，繪出一個或多個 Dot Plots（點圖）。從 Dot Plot 對話框中選取 Acquisition 作為圖形資料來源，并確定適當(dāng)?shù)?x 軸和 y 軸參數(shù)。

3． 選取屏幕左列繪圖工具中的 Histogram，同上法可繪出 Histogram（直方圖）。

4． 將此視窗命名后儲存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP 文件夾中，下次進(jìn)行相同實驗時可直接調(diào)用。

注：本計算機(jī)中已設(shè)定兩個模式文件：ACQ 和 EXP，儲存于 FACStation G3\BDApplications \CELLQuest \EXP 文件夾中，ACQ 用于細(xì)胞 DNA 檢測，EXP用于細(xì)胞表面標(biāo)志分析。

 

三．用 CELLQuest 進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整

1． 從蘋果畫面中選取 CELLQuest，進(jìn)入 CELLQuest 后在 File 指令欄中打開合適的獲取模式文件。

2． 從屏幕上方 Acquire 指令欄中，選取 Connect to Cytometer（快捷鍵：＋B）進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的 Acquisiton Control 對話框移至合適位置。

3． 從 Cytometer  指令欄中，開啟 Detectors/Amps 、 Threshold 、Compensation、Status 等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也可以用  +1，2，3，4 獲得此四個對話框。

4． 在 Detectors/Amps 對話框中，先為每個參數(shù)選擇適當(dāng)?shù)谋对瞿Ｊ?amplifier mode)：線性模式 Lin 或?qū)��?shù)模式 Log。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時，F(xiàn)SC 和 SSC 多以線性模式Lin 測量，且 DDM Param 選擇 FL2，而 FL1, FL2 與 FL3 則以對數(shù)模式 Log 測量；分析細(xì)胞 DNA 含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以 Lin 進(jìn)行測量，且 DDM Param 選擇 FL2；分析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3 等均以 Log 進(jìn)行測量。

5． 放上待檢測的樣品，將流式細(xì)胞儀設(shè)定于 RUN，流速可在 HIGH 或 LOW 上。

6． 在 Acquisiton Control 對話框中，選取 Acquire，開始獲取細(xì)胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選取 Pause，Restart 以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉 SETUP 前的“ ”。

7． 在 Detectors/Amps 對話框中，調(diào)整 FSC 和 SSC 探測器中的信號倍增度：PMT voltages（粗調(diào)）與 Amp Gains（細(xì)調(diào)），使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC 點圖內(nèi),且三群細(xì)胞合理分布。

8． 在 Threshold 對話框中選擇適當(dāng)?shù)膮��?shù)設(shè)定 Threshold，并調(diào)整Threshold 的高低，以減少噪音信號（細(xì)胞碎片）。一般做細(xì)胞表型時用 FSC－H 而做 DNA 時用 FL2－H。Threshold 并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質(zhì)量。

9． 從屏幕左列繪圖工具中選取 Region（區(qū)域），并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說的門。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更為容易。

10．在 Detectors/Amps 對話框中，調(diào)整熒光檢測器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細(xì)胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。

11．在 Compensation 對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色（或多色）熒光染色所需的熒光補(bǔ)償。比如應(yīng)該為 FL1+ FL2- 的細(xì)胞群卻分布在 FL1＋ FL2＋區(qū)域內(nèi)，則需調(diào)大 FL2－？％FL1 中的“？”，并從 FL1-FL2 點圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)

 

12．在 Status 對話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready 為14.7mW，Standby 為 5mW；Laser current:正常值為 6Amps 左右。

13．調(diào)整好的儀器設(shè)定可在 Instrument Settings 對話框中儲存，下次進(jìn)行相同實驗時可調(diào)出使用，屆時只需微調(diào)即可

注：本計算機(jī)中已有三個名叫儲存于 FACStation G3 \BD Applications\CELLQuest  Folder  \IMM-InstrSettings  及 FACStation  G3  \BD  Files\Instrument Settings Files \CalibFile 和 Mast-Cell-Set 的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細(xì)胞，后者用于分析小鼠肥大細(xì)胞。

 

四．通過預(yù)設(shè)的獲取模式文件進(jìn)行樣品分析

1． 從蘋果標(biāo)志中選擇 CELLQUEST，新視窗出現(xiàn)后從 File 指令欄中選擇Open，打開預(yù)設(shè)的獲取模式文件。

2． 從屏幕上方 Acquire 指令欄中，選取 Connect to Cytometer 進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的 Acquisiton Control 對話框移至合適位置。

3． 從 Cytometer 指令欄中選取 Instrument Settings，在其對話框中選擇Open 以調(diào)出以前存儲的相同實驗的儀器設(shè)定，按 Set 確定。

4． 在 Acquire 指令欄中，選擇 Acquisition&Storage 決定儲存的細(xì)胞數(shù)，參數(shù)，信號道數(shù)。其中 Resolution 在做細(xì)胞表面標(biāo)志時選擇 256，做DNA 時選擇 1024。Parameter Saved…則根據(jù)不同的檢測對象選擇不同的參數(shù)。

5． 在 Acquire 指令欄中，選擇 Parameter Description，以決定文件存儲位置(folder)，文件名稱(file)，樣品代號以及各種參數(shù)的標(biāo)記(panel)，即安排 tube1，2，3…的檢測參數(shù)。一般本儀器獲取的數(shù)據(jù)按照檢測對象的不同分別儲存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuest\IMM 和 DNA 文件夾中。文件根據(jù)日期命名。

6． 在 Cytometer 指令欄中，選擇 Counters，將此對話框移至合適位置，以便于隨時觀察 events 計數(shù)。

7． 將樣品試管放至檢測區(qū)，在 Acquire Control 對話框中選取 Acquire 以啟動樣品分析測定。

8． 微調(diào)儀器設(shè)定，待細(xì)胞群分布合適后選擇 Acquire Control 對話框中Pause, Abort, 去除 Setup 前的“ ”，開始正式獲取信號，存儲數(shù)據(jù)。

9． 當(dāng)一定數(shù)目的細(xì)胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數(shù)據(jù)。重復(fù)步驟 7，繼續(xù)分析下一個樣品，直到所有的樣品數(shù)據(jù)分析完畢。

注：當(dāng)所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水，并將流式細(xì)胞儀置于“STANDBY”狀態(tài)，以保護(hù)激光管。

 

五．關(guān)機(jī)程序：

1． 從 File 中選擇 Quit, 退出軟件，選擇 Don’t Save 至蘋果屏幕。

2． 用 4ml 1：10 稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去約 2ml，在將樣品架置于中位（vacuum is off），再 HIGHRUN 5 分鐘（內(nèi)管吸去 2ml）。

3． 改用三蒸水 4ml 作樣品,同上處理。

4． 按 Prime 三次。

5． 此時儀器自動轉(zhuǎn)為 STANDBY 狀態(tài)，換 2ml 三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態(tài) 10 分鐘后再依次關(guān)掉計算機(jī)、打印機(jī)、主機(jī)、穩(wěn)壓電源，以延長激光管壽命，并確保應(yīng)用軟件的正常運行。

6． 填寫使用登記表。