過氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒

 

分光光度法 50 管/48 樣

 

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

 

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

測定原理：

 

POD 催化 H₂O₂ 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。

 

需自備的儀器和用品：

 

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑的組成：

 

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

 

試劑二：液體×2 瓶，4℃保存；用時每瓶加入 5mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存；試劑三：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

 

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

 

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

 

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟和加樣表：

 

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 470nm，蒸餾水調(diào)零。

 

2、 測定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。

 

3、 樣本測定表

 

試劑名稱（µL）	測定管
樣本	15
蒸餾水	270
試劑一	520
試劑二	130
試劑三	135

 

在 1mL 玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時，記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計(jì)算 ΔA＝A2-A1。

注意：

 

1、若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上，測定時加入 15µL 樣本和 1055µL 混合液測定。

 

2、如果 ΔA 小于 0.005，可將反應(yīng)時間延長到 5min。如果 ΔA 大于 0.5，可將樣本用提取液

 

稀釋后測定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

POD 活性計(jì)算：

 

1、血清（漿）POD 活性

 

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。計(jì)算公式：

 

POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =7133×ΔA

 

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性

 

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

 

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

 

POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

 

（2）按樣本鮮重計(jì)算

 

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

 

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

 

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

單位定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

 

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =14.27×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.07mL； V 樣：加入樣本體積，0.015mL；V 樣總：加入提取

液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。