在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)這樣或那樣的問題，這些問題從細(xì)胞生長角度來說，針對細(xì)胞不貼壁、生長緩慢、生長不好，甚至死亡的原因，我們做以下分析并提出相對應(yīng)的解決方法。

一、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因： 

•胰蛋白酶消化過度；

•支原體污染；

•培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO₃分解）；

•細(xì)胞老化；

•接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。

解決方法： 

•縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度； 

•分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；

•使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO₂；

•啟用新的保種細(xì)胞；

•調(diào)節(jié)接種細(xì)胞濃度。

二、培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢

可能原因：

•由于更換不同培養(yǎng)液或血清； 

•培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞； 

•培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染； 

•試劑保存不當(dāng)； 

•接種細(xì)胞起始濃度太低； 

•細(xì)胞已老化； 

•支原體污染 。

解決方法： 

•比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液； 

•換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子；

•用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；

•血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；

•增加接種細(xì)胞起始濃度； 

•換用新的保種細(xì)胞； 

•分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

三、培養(yǎng)細(xì)胞生長不好

可能原因：

•細(xì)胞本身的狀態(tài)

細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化；

細(xì)胞的接種量：接種量過低，細(xì)胞生長緩慢；

細(xì)胞傳代時間過晚：細(xì)胞中毒，影響傳代后的細(xì)胞生長；

胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細(xì)胞死亡；時間過短，細(xì)胞未完全分離而成團(tuán)，細(xì)胞死亡；

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速融。

•污染

支原體污染；

霉菌污染。

•培養(yǎng)基或血清

更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗證；

選擇的培養(yǎng)基是否合適；

培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。

•培養(yǎng)環(huán)境

CO₂供應(yīng)是否正常；

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。

解決方法：

根據(jù)以上四個方面的可能原因，做出針對性的解決方案

•注意細(xì)胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù)、接種量等；

•避免產(chǎn)生污染（用正規(guī)、合法、可溯源的血清）；

•要用合適的血清或培養(yǎng)基，經(jīng)過驗證；

•注意實驗室的環(huán)境。

四、培養(yǎng)細(xì)胞死亡

可能原因： 

•培養(yǎng)箱內(nèi)無CO₂； 

•培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大； 

•細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷； 

•培養(yǎng)液滲透壓不正確； 

•培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積 。

解決方法： 

•檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO₂； 

•檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度； 

•取新的保存細(xì)胞種； 

•檢測培養(yǎng)液滲透壓； 

•換入新鮮培養(yǎng)液。

下面為您推薦Esco產(chǎn)品——CelCradle系列生物反應(yīng)器—高密度細(xì)胞培養(yǎng)的搖籃

一、什么是CelCradle生物反應(yīng)器

CelCradle生物反應(yīng)器根據(jù)潮汐漲落原理設(shè)計而成，其中波紋管的壓縮和解壓可使細(xì)胞不斷接觸培養(yǎng)基的營養(yǎng)與空氣，提供了一個低細(xì)胞撕裂、無泡沫、高氧氣飽和度以及高營養(yǎng)濃度的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。

CelCradle是用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)的一款易于使用的經(jīng)濟型臺式生物反應(yīng)器，既可以高密度培養(yǎng)細(xì)胞，也可以收集細(xì)胞分泌產(chǎn)物。

二、CelCradle潮汐式工作原理

通過CelCradle細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部的波紋管壓縮和解壓，細(xì)胞間歇的暴露在空氣和培養(yǎng)基中，使細(xì)胞充分與培養(yǎng)基和氧氣接觸，和滾瓶的原理類似。

三、CelCradle生物反應(yīng)器產(chǎn)品特點

•大面積高密度貼壁細(xì)胞培養(yǎng)空間

•預(yù)先滅菌、隨時可用

•一次性使用CelCradle培養(yǎng)瓶，操作簡單

•低剪切力、低細(xì)胞撕裂、無泡沫以及無氧氣限制高營養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

•兼容大多數(shù)無血清培養(yǎng)基

•全細(xì)胞、細(xì)胞組分或細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)和采集功能

四、為什么選擇CelCradle生物反應(yīng)器

1. 簡便易用的設(shè)計，一次性使用可以節(jié)約空間和人力資源

CelCradle生物反應(yīng)器是一款隨時可用的一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)，無需啟動時間及復(fù)雜的學(xué)習(xí)過程。

CelCradle生物反應(yīng)器可放置在6立方英尺CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)，并且可同時運行4個細(xì)胞培養(yǎng)瓶。 一個標(biāo)準(zhǔn)CelCradle細(xì)胞培養(yǎng)瓶帶有5.5g BioNoc II載體，可提供15000平方厘米的細(xì)胞培養(yǎng)總面積，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)可達(dá)到4~5x10⁹/瓶，相當(dāng)于18至20個滾動式細(xì)胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)量。

可以通過增加CelCradle培養(yǎng)瓶數(shù)或者使用同為潮汐原理的TideCell生物反應(yīng)器實現(xiàn)細(xì)胞規(guī)模的擴大化生產(chǎn)，從而簡化了培養(yǎng)系統(tǒng)規(guī)模擴大的過程以及節(jié)省了開發(fā)過程中所需的支出。

2. 高細(xì)胞產(chǎn)量，特殊的B_H功能促進(jìn)蛋白表達(dá)

一臺CelCradle生物反應(yīng)器可取代數(shù)百個培養(yǎng)皿、傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及多組細(xì)胞培養(yǎng)滾瓶等等，從而大大縮減生產(chǎn)成本。

該系統(tǒng)不僅可實現(xiàn)較高的細(xì)胞產(chǎn)量，且這種特殊的B_H功能（增加底部保持時間）不僅限制了細(xì)胞的過度生長而且增加了超過3倍的蛋白表達(dá)，同時還可實現(xiàn)更高的蛋白濃度并在培養(yǎng)過程中節(jié)省培養(yǎng)基。

五、應(yīng)用領(lǐng)域

•哺乳動物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)

•蛋白質(zhì)和病毒生產(chǎn)

•單克隆抗體生產(chǎn)

•蛋白質(zhì)組研究

•藥物研發(fā)

•藥物代謝動力學(xué)研究

•基因和細(xì)胞治療研究

專業(yè)論文支持

以下是一些現(xiàn)有支持CelCradle細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的科學(xué)研究應(yīng)用的學(xué)術(shù)論文

[1]Akiyama, M., Nakayama, D., Takeda, S., Kokame, K., Takagi, J., & Miyata, T. (n.d.). Crystal structure and enzymatic activity of an ADAMTS-13 mutant with the East Asian-specific P475S polymorphism. J Thromb Haemost Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1399-1406. 

 

[2]Asaoka, Y., Tanaka, T., Tsumoto, K., Tomita, M., & Ide, T. (n.d.). Efficient expression of recombinant soluble human FcγRI in mammalian cells and its characterization. Protein Expression and Purification, 155-161. 

 

[3]Brown, A., Mcsharry, J., Adams, J., Kulawy, R., Barnard, R., Newhard, W., . . . Drusano, G. (2011). Pharmacodynamic Analysis of a Serine Protease Inhibitor, MK-4519, against Hepatitis C Virus Using a Novel In Vitro Pharmacodynamic System. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1170-1181. 

 

[4]Chen, Y., Wu, J., Wang, K., Chiang, Y., Lai, C., Chung, Y., & Hu, Y. (n.d.). Baculovirus-mediated production of HDV-like particles in BHK cells using a novel oscillating bioreactor. Journal of Biotechnology, 135-147. 

 

[5]Drugmand, J., J.-F., J., Agathos, S., & Schneider, Y. (n.d.). Growth of Mammalian and Lepidopteran Cells on BioNOC II Disks, a Novel Macroporous Microcarrier. Cell Technology for Cell Products, 781-784. 

 

[6]Hammonds, J., Chen, X., Zhang, X., Lee, F., & Spearman, P. (n.d.). Advances in methods for the production, purification, and characterization of HIV-1 Gag–Env pseudovirion vaccines. Vaccine, 8036-8048. 

 

[7]Haredy, A., Takenaka, N., Yamada, H., Sakoda, Y., Okamatsu, M., Yamamoto, N., . . . Okamoto, S. (2013). An MDCK Cell Culture-Derived Formalin-Inactivated Influenza Virus Whole-Virion Vaccine from an Influenza Virus Library Confers Cross-Protective Immunity by Intranasal Administration in Mice. Clinical and Vaccine Immunology, 998-1007. 

 

[8]Haredy, A., Yamada, H., Sakoda, Y., Okamatsu, M., Yamamoto, N., Omasa, T., . . . Yamanishi, K. (2014). Neuraminidase gene homology contributes to the protective activity of influenza vaccines prepared from the influenza virus library. Journal of General Virology, 2365-2371. 

 

[9]Ho, L., Greene, C., Schmidt, A., & Huang, L. (n.d.). Cultivation of HEK 293 cell line and production of a member of the superfamily of G-protein coupled receptors for drug discovery applications using a highly efficient novel bioreactor. Cytotechnology, 117-123. 

 

[10]Hu, Y., Lu, J., & Chung, Y. (n.d.). High-density cultivation of insect cells and production of recombinant baculovirus using a novel oscillating bioreactor. Cytotechnology, 145-153.

 

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