報(bào)告基因?qū)τ诨�因表達(dá)的研究來說是非常有用的工具，它可以代替要研究的目的基因，從而幫助我們了解目的基因的信號(hào)通路和相關(guān)的疾病。熒光素酶是最常用的報(bào)告基因，使用光度計(jì)和化學(xué)發(fā)光功能的微孔板讀板機(jī)我們可以很容易的檢測(cè)到熒光素酶，另一方面，由于在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中其背景較低，因此具有很高的靈敏度。我們通常用螢火蟲熒光素酶表達(dá)水平高低反映出我們感興趣的基因在系統(tǒng)中的地位。而海腎來源的熒光素酶則更常在多熒光實(shí)驗(yàn)中作為第二種報(bào)告基因，來規(guī)范化多種在不同樣本中變化較大的指標(biāo)如轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞活力等。

 

SpectraMax® DuoLuc™ Reporter 試劑盒可以對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的螢火蟲和海腎熒光素酶進(jìn)行高靈敏度的定量。依次向微板孔中加入兩種適量的反應(yīng)試劑即可檢測(cè)熒光。這種雙熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)可以在歸一化檢測(cè)熒光信號(hào)(螢火蟲熒光)的同時(shí)提供持續(xù)表達(dá)的對(duì)照熒光信號(hào)(海腎熒光)。運(yùn)用SpectraMax® iD5 多功能微孔板讀板機(jī)、注射器系統(tǒng)和 SmartInject™ 技術(shù)可以將實(shí)驗(yàn)條件最優(yōu)化。

 

在這里我們將展示如何在哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型中， 通過雙熒光報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)和SpectraMax iD5微孔板讀板機(jī)來檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF- κB)的活性。NF- κB是參與細(xì)胞進(jìn)程中許多基因表達(dá)的“主要調(diào)節(jié)者”，如炎癥，免疫，分化，增殖和凋亡。腫瘤壞死因子α (TNF- α)可以激活細(xì)胞信號(hào)通路來降解NF- κB的抑制劑，從而促使其釋放并進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)數(shù)百目的基因的表達(dá)。NF- κB通路的紊亂可以誘發(fā)多種疾病，如多發(fā)性硬化病，糖尿病，阿爾茲海默病等，因此利用合適的工具加深我們對(duì)NF- κB通路的理解是十分必要的。

 

• 靈敏的雙報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)多熒光素酶

• 用對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)行均一化，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度

• SoftMax Pro軟件的預(yù)置模板可簡(jiǎn)化操作

圖1 NF-κB信號(hào)通路。TNF-α激活信號(hào)層級(jí)反應(yīng)使NF-κB抑制劑IKB降解，并釋放NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。

材料

• SpectraMax 雙報(bào)告試劑盒(Molecular Devices cat. #R8361)

• HEK 293 細(xì)胞系 (ATCC cat. #CRL-1573)

• 培養(yǎng)基: DMEM + 10% fetal bovine serum +penicillin/streptomycin

• pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro] 螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒 (Promega cat. #E849A)

• pGL4.75[hRluc/CMV] 海腎熒光素酶質(zhì)粒(Promega cat. #E693A)

• FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega cat. #E2311)

• Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基(ThermoFisher Scientific cat. #31985062)

• 96孔白板 (Corning cat. #3610)

• TNF-α 10 μg/mL PBS + 1 mg/mL BSA溶液(Sigma cat. #T0157)

• BrightMax 密封薄膜(Excel Scientific cat. #WT-50)

• SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)

• 具有 SmartInject技術(shù)的注射器系統(tǒng)

 

表1 轉(zhuǎn)染試劑體積與不同DNA含量的比例。

 

HEK293細(xì)胞(80%融合度)用胰酶消化后分到96孔白板中，每孔15,000細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞超過50% 融合度時(shí)，用NF- κB-RE 螢火蟲熒光素酶和海腎對(duì)照組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，其中使用三種不同比例FuGENE和DNA組合方式，轉(zhuǎn)然后，細(xì)胞置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

 

將10 μg/mL TNF-α的溶液用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到20ng/ml制成誘導(dǎo)溶液。無添加培養(yǎng)基作為對(duì)照。操作時(shí)將原培養(yǎng)基移除后加入100μL對(duì)照或誘導(dǎo)溶液，之后將板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育7小時(shí)。

圖2 原始發(fā)光值數(shù)據(jù)。圖中所示為不同轉(zhuǎn)染條件下(轉(zhuǎn)染試劑：DNA比值)TNF-α未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的RFU值。每個(gè)轉(zhuǎn)染條件有9個(gè)重復(fù)。

 

圖3 均一化發(fā)光值結(jié)果。用海腎發(fā)光值對(duì)螢火蟲RLU做均一化。

 

移除細(xì)胞培養(yǎng)基后孔中細(xì)胞用PBS洗兩次。裂解緩沖液恢復(fù)至室溫后每孔加入20μL。室溫下溫柔震蕩15分鐘促進(jìn)細(xì)胞裂解。在板底安上一個(gè)白板密封蓋以增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度。

 

試劑盒中的試劑使用前需在室溫下孵育。向裝有2 . 2 m g 凍干底物的小瓶中加入220μL水混勻后即為螢火蟲酶底物。向裝有440μg凍干底物的小瓶中加入220μL水混勻后即為水蛭素腸桿菌素。用螢火蟲檢測(cè)緩沖液按1:50比例稀釋螢火蟲酶底物后即為螢火蟲工作液。用海腎熒光素酶緩沖液按1:50比例稀釋水蛭素腸桿菌素后即為海腎工作液。對(duì)一個(gè)96孔板來說，每種工作液(working solution)我們需要11mL，其中包含220μL各自的底物(substrate)。SoftMax® Pro Software中預(yù)配置的程序可以幫助執(zhí)行實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果分析，這需要以下的參數(shù)設(shè)置：

1、使用注射器1向孔中加入100μL螢火蟲工作液

2、等2秒鐘使反應(yīng)充分

3、設(shè)置integration time 5秒檢測(cè)螢火蟲熒光

4、使用注射器2向孔中加入100μL海腎工作液

5、等2秒鐘使反應(yīng)充分

6、設(shè)置integration time 5秒檢測(cè)海腎熒光

7、對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔，需要將第一次測(cè)量(firefly熒光)與第二次測(cè)量(海腎熒光)的RLU值相比獲得數(shù)據(jù)。

SpectraMax iD5注射器模塊和SmartInject技術(shù)可以在加入試劑的過程中進(jìn)行震蕩，從而保證試劑充分混勻以最大限度的獲得螢火蟲和海腎的熒光信號(hào)。

表2 在誘導(dǎo)與不誘導(dǎo)情況下不同轉(zhuǎn)染條件下獲得的比值。最好的條件是轉(zhuǎn)染試劑：DNA為2.5:1。

 

相對(duì)于誘導(dǎo)條件的變化而言，各種轉(zhuǎn)染條件均能檢測(cè)到海腎熒光素酶的高表達(dá)，而加入細(xì)胞因子TNF-α?xí)�大大增加螢火蟲熒光素酶的表達(dá)水平(圖2)�？傊�，轉(zhuǎn)染試劑與DNA比例為2:1時(shí)熒光素酶的表達(dá)水平較其他比例而言最低。結(jié)果顯示誘導(dǎo)條件下，三種轉(zhuǎn)染比例條件下螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶均一化讀值較高(圖3)。然而均一化比值在3:1和2.5:1的轉(zhuǎn)染條件下較低，但是加TNF- α誘導(dǎo)的與不加的倍比關(guān)系明顯較大。表2顯示三種轉(zhuǎn)染條件下誘導(dǎo)的倍比關(guān)系，最好的誘導(dǎo)倍比條件是試劑： DNA比例為2.5:1。

 

在HEK293細(xì)胞系應(yīng)用雙報(bào)告基因檢測(cè)法，我們證實(shí)了加入TNF-α強(qiáng)烈誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)。由于此系統(tǒng)對(duì)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶都敏感，都可得到較強(qiáng)的信號(hào)。三種轉(zhuǎn)染條件下，我們加入TNF-α誘導(dǎo)使NF-κB均一化后的最佳比值可達(dá)到54倍。

使用SpectraMax® iD5 多功能微孔板讀板機(jī)、具有SmartInject™ 技術(shù)的注射器系統(tǒng)，可用于檢測(cè)SpectraMax® DuoLuc™Reporter 實(shí)驗(yàn)。預(yù)置的操作流程簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)采集和分析的操作。SpectraMax Pro軟件可助你快速完整、靈敏可靠的獲得雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果。

 

Reference

1. Oeckinghaus, A and Ghosh, S. The NF-κB Family of Transcription Factors and Its Regulation.

Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009 Oct; 1(4): a000034.