簡介

SpectraMax® M5e多功能微孔板讀板機具有雙單色器，能夠進行熒光、時間分辨熒光(TRF)、熒光偏振、光吸收和化學發(fā)光檢測。它具有HTRF®(均相時間分辨熒光)認證的優(yōu)勢，使得生命科學和藥物發(fā)現(xiàn)研究者們通過TRF檢測的高度靈活性提高產(chǎn)出。

HTRF®是Cisbio Bioassays公司開發(fā)的一項檢測生物分子相互作用的多用途技術1。此技術結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和TRF的特點，采用銪(Eu)的穴狀化合物作為供體熒光基團和一種經(jīng)過修飾的別藻藍蛋白(XL665)或小分子d2作為受體熒光基團。當標記了銪穴狀化合物和d2的生物分子相互作用時，F(xiàn)RET就會在供體和受體熒光基團間發(fā)生，可在665nm處檢測到熒光發(fā)射，此時大部分穴狀化合物的激發(fā)能量都以620nm熒光發(fā)射釋放出來�？着c孔之間的差異通過利用Cisbio專利的HTRF比值算法校正，此算法使用的是665nm和620nm的熒光信號比值。

HTRF測定在SpectraMax M5e讀板機上的表現(xiàn)通過使用兩種不同的HTRF檢測試劑展示。G-蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導通過檢測兩種主要通路，cAMP的調(diào)控和IP3介導的胞內(nèi)鈣離子水平增加。利用cAMPdynamic 2試劑中Eu的穴狀化合物標記的單克隆抗-cAMP抗體和d2-標記的cAMP進行檢測。由細胞本身產(chǎn)生的cAMP與cAMP-d2競爭結(jié)合抗-cAMP抗體穴狀化合物。細胞內(nèi)cAMP的增加導致FRET降低，檢測到的665nm熒光下降了。IP-One測定采用相似的方式并使用IP1特異的單克隆抗體，一種穩(wěn)定的在氯化鋰存在下富集于信號轉(zhuǎn)導細胞中的IP3下游代謝產(chǎn)物。665nm熒光與IP1濃度在校準品或細胞裂解物中成反比。這篇應用文獻展示了兩種基于細胞的檢測數(shù)據(jù)和由cAMP dynamic 2和IP-One試劑盒得到的標準曲線。這些HTRF數(shù)據(jù)揭示了在SpectraMax M5e讀板機上得到的完美動態(tài)范圍和Z’ 因子。

優(yōu)勢

- 于雙單色器系統(tǒng)的靈活性
- 極寬的動態(tài)范圍和完美的Z’因子
- SoftMax Pro自帶預設HTRF實驗模板

材料

- cAMP dynamic 2 試劑盒，1000個測試(Cisbio cat. #62AM4PEB)
- IP-One 試劑盒, 1000個測試(Cisbio cat. #62IP1PEB)
- 細胞系：CHO-M1 (M1WT3;ATCC cat. #CRL-1985)
- 福斯高林(Sigma cat. #F3917)
- 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma cat. #I7018)
- 氯化氨甲酰膽堿(碳酰膽堿;Sigma cat. #C4382)
- 白色384-孔微孔板(Corning cat. #3705)
- SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機(Molecular Devices)
注意：通常在SpectraMax M5e上檢測HTRF使用的是白色微孔板。為優(yōu)化信號檢測，使用不透明白色微孔板而非底透板。

方法

cAMP dynamic 2測定

CHO-M1細胞生長于添加了10% FBS、1%青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺和200 μg/mLG418的Ham F12培養(yǎng)基中。使用懸浮細胞進行cAMP dynamic 2測定。細胞于測定當天進行胰酶消化，重懸于無添加的Ham F12培養(yǎng)基中，并以每孔4,000細胞、10 μL體積接種于白色384-孔微孔板中。為了刺激cAMP產(chǎn)生，添加檢測試劑前用10 μL終濃度為3 nM到1 mM福斯高林處理處理細胞一小時。測試孔中加入0.5 mMIBMX以抑制磷酸二酯酶介導的cAMP降解。

福斯高林處理一小時后，按照產(chǎn)品說明書中所述加入cAMP-d2、裂解緩沖液和抗-cAMP抗體-穴狀化合物。細胞陰性質(zhì)控包含接受了抗-cAMP抗體-穴狀化合物、偶聯(lián)物及不含cAMP-d2的裂解緩沖液的未處理細胞。FRET陰性質(zhì)控對Delta F值的計算是必要的，其在HTRF產(chǎn)品說明書中有所強調(diào)3。所有樣品和標準品的最終測定體積為40 μL，但是測定體積可以針對不同微孔板類型調(diào)整。

標準品按照cAMP dynamic 2 HTRF產(chǎn)品說明書所述準備。cAMP終濃度從0.17到 712nM，并且包括不含cAMP(最大FRET)的陽性質(zhì)控。包含自由cAMP的質(zhì)控用于檢測測定的活性，不含cAMP或cAMP-d2的陰性質(zhì)控(無FRET)用于計算DeltaF。cAMP-d2添加于所有標準品和陽性質(zhì)控中，而接受有偶聯(lián)物的陰性質(zhì)控和裂解緩沖液沒有cAMP-d2�？�-cAMP抗體-穴狀化合物添加于所有標準品和質(zhì)控中。室溫下孵育一小時后，在SpectraMax M5e讀板機上進行微孔板讀數(shù)。(請見表1 儀器設置)。

IP-One測定

CHO-M1細胞按上述方法培養(yǎng)。在測定前一天，細胞以每孔10,000?40,000接種于含有完全生長培養(yǎng)基的384-孔微孔板中。第二天，使用濃度范圍從15 nM到33 μM的碳酰膽堿刺激細胞(刺激緩沖液包含用于準備碳酰膽堿濃度的氯化鋰溶液)。刺激一小時后，IP1-d2偶聯(lián)物、裂解緩沖液和抗-IP1抗體-穴狀化合物添加于孔中。細胞陰性質(zhì)控包含接受了抗-IP1抗體-穴狀化合物、偶聯(lián)物和不含IP1-d2的裂解緩沖液的未處理細胞。最終測定體積為40 μL，但是此cAMP測定可針對不同的微孔板類型調(diào)整體積。

根據(jù)IP-One HTRF產(chǎn)品說明書所述在刺激緩沖液中溶解IP1標準品，使IP1標準品終濃度范圍從21.5到22,000 nM 4。孵育陽性IP1和不含IP1的陰性質(zhì)控。IP1-d2添加于所有標準品和陽性IP1質(zhì)控中，而接受了偶聯(lián)物的陰性質(zhì)控和裂解緩沖液不含IP1-d2�？�-IP1抗體抗體-穴狀化合物添加于所有樣品中。室溫孵育一小時后，根據(jù)表1中的設置在SpectraMax M5e讀板機上進行微孔板讀數(shù)。

數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Cisbio的指南使用SoftMax? Pro軟件對cAMP和IP-One進行數(shù)據(jù)分析。SoftMax Pro軟件中的4個不同的HTRF預設實驗模板專為各種現(xiàn)階段可用類型的HTRF測定設計以簡化數(shù)據(jù)采集和分析。

儀器設置

波長、延遲和整合設置都已針對基于雙單色器的SpectraMax M5e讀板機進行了優(yōu)化。尤其注意，XL665/d2的最佳發(fā)射波長為668nm而非HTRF產(chǎn)品信息中所說的665nm。

結(jié)果

最佳結(jié)果來自基于細胞的cAMP測定，其使用384-孔微孔板并以每孔大約4,000CHO-M1細胞接種(40 μL檢測終體積)。最優(yōu)細胞密度根據(jù)細胞類型和特定測定條件可能改變。用福斯高林處理細胞一小時后，獲得關于EC50為11.4 μM和Z’ 因子為0.86的劑量應答曲線(圖1)。使用Cisbio比值方程計算的Delta F%值范圍從47到707(表2)，與觀察到的cAMP標準曲線(圖2，表3)相似。

在基于細胞的IP-One測定中，優(yōu)化的細胞密度為384-孔微孔板每孔10,000個CHO-M1細胞(40 μL最終測定體積)。碳酰膽堿刺激一小時得到的EC50為0.64 μM和Z’ 因子為0.91的劑量應答曲線(圖3)。使用Cisbio比值方程計算的Delta F%值范圍從3402到12539(表4)。

根據(jù)IP-One HTRF產(chǎn)品說明書直接準備的IP1標準品生成的校準曲線其Z’ 因子為0.84(圖4)且Delta F%值范圍從820到11883(表5)。

總結(jié)

具有HTRF認證的SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機多功能微孔板讀板機提升了雙單色器系統(tǒng)和多模式檢測功能靈活性，擴展了研究者們的檢測方法范圍。當在SpectraMax M5e讀板機上運行IP-One和cAMP HTRF測定時，展示了非常寬的動態(tài)范圍和范圍從0.78到0.91的完美Z’ 因子。使用SoftMax Pro軟件的預設HTRF實驗模板大大簡化了數(shù)據(jù)分析。

參考

1. TR-FRET Basics (www.htrf.com)
2. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg,K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol Scrn 4(2): 67-73.
3. cAMP dynamic 2 HTRF kit package insert(Cisbio international, France).
4. IP-One HTRF kit package insert (Cisbio international, France).