膀胱癌（Bladder cancer）是一種常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，由于易轉(zhuǎn)移，死亡率高，5年生存率只有8.1%。因此，研究膀胱癌的發(fā)病機制，有助于對膀胱癌的診斷和治療。circRNA是一類具有閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，是現(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組學研究的新星。本研究從circRNA的角度出發(fā)，深入闡述了一個circRNA在膀胱癌中的作用機制。

1. 膀胱癌特異性circRNA的篩選與鑒定

為篩選和膀胱癌特異性相關(guān)的circRNA，研究人員對3對配對癌組織和正常膀胱組織進行了circRNA特異性的高通量測序（伯豪生物參與），共鑒定到16,353個circRNA。其中，有88.35.%的circRNA來源于exons，有524個在癌組織中下調(diào)，47個上調(diào)。

接下來，研究人員在膀胱癌細胞系（T24T和UMUC3）中進行了RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)circHIPK3穩(wěn)定地在兩種細胞系中表達。進一步的分析和大樣本鑒定表明，circHIPK3在79.5%的膀胱癌組織中特異性降低，并與grade, invasion和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。FISH實驗表明，circHIPK3主要定位于細胞質(zhì)中。

2. circHIPK3抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲

為探究circHIPK3的生物學功能，研究人員在兩個細胞系中過表達circHIPK3，進行細胞表型檢測。結(jié)果顯示，細胞遷移和侵襲受到抑制。當siRNA敲降circHIPK3時，細胞遷移和侵襲增強。因此，circHIPK3在膀胱癌細胞中影響了細胞的遷移和侵襲能力。

3. circHIPK3在膀胱癌細胞中大量吸附miR-558

在第一篇circHIPK3的研究中，其就是通過miRNA sponge方式發(fā)揮功能。那么，在膀胱癌中，是否也是ceRNA方式呢？通過miRanda，PITA和RNAhybrid預測，發(fā)現(xiàn)有12個miRNA能與之結(jié)合。Pull down實驗表明，miR-558能在T24T和UMUC3中與circHIPK3結(jié)合。進一步的突變實驗也驗證了兩者的結(jié)合關(guān)系，F(xiàn)ISH實驗也驗證了兩者在細胞質(zhì)中的共定位。因此，circHIPK3能直接結(jié)合miR-558。

4. miR-558通過靶向HPSE影響膀胱癌細胞的遷移，侵襲和血管生成

先前的研究表明，miR-558在神經(jīng)母細胞瘤中通過促進HPSE的轉(zhuǎn)錄，而影響遷移，侵襲和血管生成，而HPSE又在膀胱癌中高表達。因此，研究人員在膀胱癌組織和細胞系中對miR-558進行了驗證，確實發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)。然后，通過過表達實驗，也發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞的遷移和侵襲增強。而抑制miR-558表達時，出現(xiàn)了相反的細胞表型。RT-PCR和Weston blot實驗表明，HPSE，VEGF，MMP-9表達在過表達時增強，抑制表達時減弱。因此，miR-558通過靶向HPSE影響膀胱癌細胞的遷移，侵襲和血管生成。

5. 過表達circHIPK3逆轉(zhuǎn)miR-558對細胞的影響

circHIPK3和miR-558的結(jié)合關(guān)系搞清楚了，兩者的生物學功能也是一致的，那么他們是不是通過這種關(guān)系在同一條路上起作用呢？結(jié)果顯示，過表達circHIPK3，HPSE，VEGF，MMP-9表達顯著降低，而當敲降circHIPK3時，都顯著上調(diào)。那么是否是通過結(jié)合miR-558發(fā)揮功能呢？把miR-558 mimic和過表達circHIPK3共轉(zhuǎn)染，可以發(fā)現(xiàn)HPSE，VEGF，MMP-9表達顯著降低了，遷移和侵襲也降低。因此，circHIPK3確實是通過吸附miR-558，調(diào)控了HPSE的轉(zhuǎn)錄來影響細胞的遷移，侵襲和血管生成。

6. 小鼠模型實驗驗證circHIPK3的生物學功能

體外細胞實驗驗證了功能，在體內(nèi)是否work，這是一個問號。因此，研究人員將轉(zhuǎn)染circHIPK3的T24T細胞移植到裸鼠中。結(jié)果顯示，腫瘤的生長速率和質(zhì)量比對照低。免疫組化實驗顯示，HPSE，VEGF，MMP-9表達受到抑制，CD31+，平均血管密度減少。另外，轉(zhuǎn)移模型實驗也明顯顯示，過表達circHIPK3的小鼠肺轉(zhuǎn)移能力減弱。因此，小鼠實驗也有效地驗證了circHIPK3對膀胱癌生長，血管生成和轉(zhuǎn)移的影響。

研究結(jié)論

本研究通過高通量篩選，體內(nèi)體外的功能驗證實驗，報道了一個已經(jīng)有研究的circRNA在膀胱癌中的生物學功能。當然，在膀胱癌中，circHIPK3是第一次報道，也是通過了吸附和之前報道的不同的miRNA發(fā)揮功能。因此，做circRNA研究，無論是有過研究，還是沒有研究過的，只要能把機制說清楚了，功能說明白了，都能在比較好的雜志上發(fā)表。

原文出處：Li Y, Zheng F, Xiao X, Xie F, Tao D, Huang C, Liu D, Wang M, Wang L, Zeng F, Jiang G. CircHIPK3 sponges miR-558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells. EMBO reports.2017.