研究背景

近年來，基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使研究人員對(duì)放線菌的代謝網(wǎng)絡(luò)有了更加深入的了解。I型聚酮化合物-格爾德霉素是一種很有效的抗腫瘤藥物。本研究作者通過對(duì)格爾德霉素（geldanamycin）產(chǎn)生菌Streptomyces hygroscopicus （S. hygroscopicus）XM201進(jìn)行基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找到了格爾德霉素生物合成的關(guān)鍵限速步驟，并通過對(duì)關(guān)鍵限速步驟中基因的啟動(dòng)子用內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子替換的方式，使格爾德霉素的產(chǎn)量得到了很大程度的提高。

研究結(jié)果

1. S. hygroscopicus XM201的全基因組測(cè)序

采用Illumina HiSeq2500和PacBio® RS II System結(jié)合的方法（由伯豪生物完成）對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并將基因組測(cè)序結(jié)果與已有的鏈霉菌測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。S. hygroscopicus XM201的核心區(qū)域與其他鏈霉菌類似，但非核心區(qū)域較大，約為6.0Mb。

在XM201中有45個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，其中有10個(gè)合成基因簇編碼聚酮化合物，包括格爾德霉素。

2. geldanamycin生物合成相關(guān)基因

XM201中的geldanamycin生物合成基因簇大小為70 kb, 包含23 個(gè)ORFs。需要注意的是，前體AHBA合成相關(guān)的基因距離geldanamycin生物合成基因簇為8.8Mb。

3.聚酮合成酶相關(guān)基因被認(rèn)為是格爾德霉素產(chǎn)量的限速步驟

在七天的發(fā)酵過程中，格爾德霉素的快速積累發(fā)生在第一天到第四天。為了搞清楚格爾德霉素產(chǎn)量的限速基因，對(duì)第四天的發(fā)酵樣品進(jìn)行了取樣及全轉(zhuǎn)錄測(cè)序（由伯豪生物完成）。發(fā)現(xiàn)聚酮鏈延伸中的相關(guān)基因?yàn)楦駹柕旅顾禺a(chǎn)量的限速基因。

4.篩選格爾德霉素產(chǎn)量提高的強(qiáng)啟動(dòng)子

為了篩選強(qiáng)啟動(dòng)子，XylE作為評(píng)估各啟動(dòng)子活性的報(bào)告基因。通過對(duì)第一天樣本中各啟動(dòng)子的XylE活性實(shí)驗(yàn)和對(duì)四個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子5063p, 6214p, 7138p和7359p發(fā)酵1-4天的XylE活性實(shí)驗(yàn)，5063p被確認(rèn)為提高格爾德霉素的聚酮合成相關(guān)基因表達(dá)水平的強(qiáng)啟動(dòng)子。

5.強(qiáng)啟動(dòng)子5063p使格爾德霉素的產(chǎn)量得到了提高

將gdmA1p替換為強(qiáng)啟動(dòng)子5063p后，基因gdmA1和gdmA3的表達(dá)水平得到了明顯的提升，格爾德霉素的產(chǎn)量相對(duì)于原始菌株也提高了39%。

6. AHBA生物合成相關(guān)基因的過表達(dá)使格爾德霉素產(chǎn)量進(jìn)一步提高

3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）為格爾德霉素生物合成的前體物質(zhì)。通過外源添加AHBA實(shí)驗(yàn)表明，在替換為強(qiáng)啟動(dòng)子5063p的菌株中，AHBA的低表達(dá)量成為新的限速步驟。故通過用強(qiáng)啟動(dòng)子5063p替換AHBA合成基因的啟動(dòng)子，使格爾德霉素產(chǎn)量獲得了進(jìn)一步提高，相對(duì)于原始菌株提高了88%。

原文出處：Wang X, Ning X, Zhao Q, Kang Q, Bai L. Improved PKS gene expression with strong endogenous promoter resulted in geldanamycin yield increase. Biotechnol J. 2017.