組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
組織乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)中釋放出巰基膽堿，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，出現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體等）乙酰膽堿酯酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱(chēng)為紅細(xì)胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細(xì)胞膜上高度表達(dá)，催化主要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，產(chǎn)生乙酸和膽堿，終止突觸傳導(dǎo)。其功能在于調(diào)節(jié)乙酰膽堿作用。神經(jīng)毒氣，例如有機(jī)磷沙林（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉癱瘓，最終發(fā)生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑中毒有關(guān)，因此血液檢測(cè)是環(huán)境污染的重要指標(biāo)�；谌斯ず铣傻孜锏饣虼阴Ｄ憠A（acetylthiocholine iodide）在乙酰膽堿酯酶的作用下，水解產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
Acetylcholinesterase
acetylthiocholine iodide → acetate + thiocholine
DTNB + thiocholine → TNB + choline-S-S-TNB
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 60毫升
裂解液（Reagent B） 10毫升
緩沖液（Reagent C） 40毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 2毫升
底物液（Reagent E） 4毫升
陰性液（Reagent F） 2毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶(hù)自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
- 樣品準(zhǔn)備
- 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入到一個(gè)液氮凍存管
- 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
- 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B）
- 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/EM>）
- 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
- 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
- 測(cè)定準(zhǔn)備
- 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零
- 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照
- 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度；底物液（Reagent E）50℃溫育溶解
- 樣品背景對(duì)照測(cè)定
- 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入100微升陰性液（Reagent F）
- 加入100微升底物液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻
- 在37℃溫度下孵育3分鐘
- 加入50微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品背景對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）
- 樣品測(cè)定
- 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入100微升底物液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻
- 在37℃溫度下孵育3分鐘
- 加入50微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）
五、計(jì)算樣品活性
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘
- 酶標(biāo)儀測(cè)定
- 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景對(duì)照和待測(cè)樣品
- 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
- 加入25微升陰性液（Reagent F）到樣品背景對(duì)照孔里
- 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）到待測(cè)樣品孔里
- 分別加入25微升底物液（Reagent E）到所有孔里
- 輕輕搖動(dòng)96孔板
- 在37℃溫度下孵育3分鐘
- 分別加入10微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
- 輕輕搖動(dòng)96孔板
- 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作
- 操作時(shí)，須戴手套
- 每個(gè)樣品均須背景測(cè)定
- 建議使用比色皿測(cè)定
- 樣品須澄清，至關(guān)重要
- 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
- 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘
- 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
- 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
- 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
- 乙酰膽堿酯酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個(gè)活性單位
- 本公司提供系列乙酰膽堿酯酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
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